黄褐毛忍冬总皂苷对卵清蛋白致敏小鼠的抗过敏作用
【摘要】 目的： 观察黄褐毛忍冬总皂苷（Ful）对卵清蛋白（OVA）致敏小鼠的抗过敏作用，为临床用于治疗食物过敏提供药理学依据. 方法： 建立BALB/c小鼠食物过敏模型，设过敏反应组（Se），Ful高（H）、中（M）、低（L）浓度组及生理盐水对照组（NS）. ELISA测定血清中OVA特异性IgE水平、小肠黏液中总IgA及OVA特异性IgA水平；甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞，HE染色观察空肠形态；足垫肿胀实验检测迟发型超敏反应. 结果： OVA隔日激发3~4次后，Se，L，M组均有3/4以上小鼠出现急性腹泻. 高浓度Ful可抑制过敏小鼠腹泻发生，减轻肥大细胞聚集和脱颗粒，降低OVA特异性IgE水平，缓解OVA介导的足垫肿胀反应，减轻小肠绒毛炎症. 结论： 高浓度Ful可同时缓解食物过敏小鼠IgE介导的及细胞介导的超敏反应.
0引言。
食物过敏是儿童期常见的变态反应性疾病，患病率逐年上升，严重影响了儿童尤其是婴幼儿的生活质量. 目前，对食物过敏治疗的研究包括免疫疗法、益生菌疗法及基因疗法［1］等. 此外，传统中药以其价廉、有效、副作用小等优点，作为抗过敏治疗的补充和替代亦受到重视. 我们前期研究已证实，单味金银花（黄褐毛忍冬）水提物对卵清蛋白（ovalbulmin, OVA）导致的速发型和迟发型变态反应均有缓解作用［2］，现进一步选用黄褐毛忍冬总皂苷（fulvotomentoside, Ful）作用于OVA致敏小鼠，观察其抗过敏作用.
1材料和方法。
1.1材料OVA（Sigma, USA）；氢氧化铝凝胶（Sigma, USA）；大鼠抗小鼠IgA（Biolegend, USA）；辣根过氧化酶（HRP）标记的大鼠抗小鼠IgE及羊抗小鼠IgA（Southern Biotechnology Associates, USA）.
1.2方法。
1.2.1黄褐毛忍冬总皂苷分离提取药材来源于贵州黔西南州种植基地，部位为黄褐毛忍冬干燥花蕾. 系贵州中医药研究院以大孔树脂工艺提取，样品中Ful含量为66.11%.
1.2.2建立动物模型及分组重庆医科大学实验动物中心提供的BALB/c小鼠连续传两代，以第3代雌鼠（6 wk龄）作为实验对象. 40只小鼠随机分为5组，每组8只. 取其中4组建立食物过敏模型，分为过敏反应组（Sensitization group, Se）以及Ful高（200 mg/kg, H）、中（100 mg/kg, M）、低（50 mg/kg, L）浓度组；另设生理盐水对照组（NS）. ①基础致敏和强化致敏：Se及H，M，L组第1日用含10 μg OVA（V级）及1 mg氢氧化铝凝胶的生理盐水0.5 mL腹腔注射腹腔注射.进行基础致敏，第15日用只含10 μg OVA（V级）的生理盐水0.5 mL腹腔注射.强化致敏，NS组腹腔注射等量生理盐水. ②激发肠道过敏反应：第20日起以OVA（Ⅱ级）生理盐水溶液0.4 mL（OVA浓度250 g/L）对Se及H，M，L组进行隔日灌胃激发直至第42日，NS组同时以等量生理盐水灌胃. ③给药：第20日起给H，M，L组依不同的体质量皮下注射相应浓度的Ful，0.01 mL/g，1次/d×22d. Se及NS组皮下注射等量生理盐水.
1.2.3血清OVA特异性IgE水平检测采用ELISA法，以每孔100 μL OVA（浓度10 mg/L）包板，血清样品按原浓度加样. 结合反应时HRP标记的大鼠抗小鼠IgE二抗稀释浓度为1∶1000， TMB显色后终止反应，全自动酶标仪测定A450 nm值.
1.2.4小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平检测肠黏液采集和处理参照文献［3］，采用ELISA法. OVA特异性IgA检测时OVA包被浓度为10 mg/L，总IgA检测时大鼠抗小鼠IgA按1∶1000稀释后包被，小肠黏液均按1∶25稀释，结合反应中二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgA，以1∶1000稀释.
1.2.5形态学观察HE染色观察空肠形态；甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞. 随机连续计数空肠10个高倍视野内肥大细胞数，取平均值代表其密度. 累计肠系膜10个高倍视野内肥大细胞总数及脱颗粒肥大细胞数，计算完整肥大细胞百分率. 完整肥大细胞百分率＝［（肥大细胞总数－脱颗粒肥大细胞数）/肥大细胞总数］×100%.
1.2.6迟发型超敏反应（DTH）检测第40日时进行足垫肿胀实验. 用游标卡尺测量小鼠后足垫厚度，之后足垫注射0.05 mL OVA（浓度2 g/L）溶液. 48 h后再次测量同一部位，以两次测量差值作为评价OVA特异性DTH的指标.
统计学处理：采用SPSS11.0统计软件. 各组数据进行方差齐性检验提示方差齐同，结果以x±s表示，用SNK法（q检验）在各组间做两两比较，P0.05为差异有统计学意义.