氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞内游离钙浓度的影响

作者：李清, 朱涛, 秦成名, 刘菊英 　[摘要] 目的:观察氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡和胞内游离钙浓度（[Ca2+]i）变化的影响。方法:取新生2~3 d Wistar大鼠T11~L6脊髓背角星形胶质细胞，原代纯化培养。将细胞随机分为：对照组（C组），谷氨酸组（G组），氯胺酮组(K组)，余下3组为谷氨酸+不同浓度氯胺酮组（标记为GK1~GK3组），培养30 min后取各细胞检测[Ca2+]i，再培养48 h检测星形胶质细胞凋亡率。结果:与C组比较，G组细胞发生了大量凋亡（P＜0.01），[Ca2+]i显著升高（P＜0.01）；与G组比较，GK2组细胞凋亡率和[Ca2+]i明显降低（P＜0.05），GK3组细胞凋亡率和[Ca2+]i显著降低（P＜0.01）。结论:适量氯胺酮通过抑制细胞内钙超载显著抑制了谷氨酸诱导星形胶质细胞凋亡。

[关键词] 氯胺酮；谷氨酸；脊髓背角；星形胶质细胞；凋亡；[Ca2+]i。

Abstract： Objective To observe the effect of ketamine on Glutamate—induced apoptosis and the intracellular dissociated Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in rat cultured spinal cord dorsal horn astrocytes. Methods Cells were derived from T11—L6 spinal cord dorsal horn of 2—3 days old Wistar rat and purified for two weeks, they were treated with following six conditions: (1)sham wash with Hanks solution (control group—C); (2)100 μmol/L of Glutamate (group—G); (3)100 μmol/L ketamine (group—K); (4—6) 100 μmol/L of Glutamate was added and 30 mins later, ketamine at 10, 50 or 100 μmol/L was superimposed, respectively (group GK1—GK3). After 30 mins or 48 hrs treatment, the [Ca2+]i and the apoptotic cell death was analyzed with flow cytometer. Results Apoptotic cell death and the [Ca2+]i was significantly increased in Group G when compared with Group C (P0.01). The apoptotic astrocytes and the [Ca2+]i was significant low in GK2 group (P0.05) and GK3 group (P0.01) than in Group G. There was no effect of ketamine itself at 100 μmol/L on apoptotic cell death and [Ca2+]i. Conclusion Ketamine at 100 μmol/L can inhibit glutamate—induced apoptosis cell death in rat cultured spinal cord dorsal horn astrocytes. Its anti—apoptotic mechanisms may be explained by inhibiting the intracellular Ca2+ overloading.

Key words: Ketamine; Glutamate; Spinal cord dorsal horn; Astrocyte; Apoptosis; [Ca2+]i。

脊髓背角的谷氨酸是初级感觉传入的主要兴奋性神经递质。外周持续性伤害刺激可使初级感觉传入神经末稍释放大量谷氨酸，激活背角星形胶质细胞，通过神经元和星形胶质细胞之间的电――化学信号转导参与伤害性信号调控，导致兴奋性毒性作用，诱发星形胶质细胞损伤或凋亡[1—2]。目前对该过程中谷氨酸诱导星形胶质细胞凋亡的机制不完全清楚。氯氨酮是一种非竞争性N—甲基—D—天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，它能通过血脑屏障与NMDA受体离子通道结合，阻断钙离子通道。有研究表明，氯胺酮可抑制脊髓星形胶质细胞的激活[3]。有关氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响尚无报道。本实验通过对大鼠脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养，用氯胺酮对此进行探讨。

1 材料与方法。

1.1 动物、主要仪器和试剂出生1～3 d Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重10～15 g(武汉大学实验动物中心)；CB150细胞培养箱(Binder公司，德国)； EPICS XL流式细胞仪(Beckman culture公司，美国)； DMEM/F12、胎牛血清和小牛血清（HyClone公司，美国）；DNA流式检测试剂盒和Fluo—3—AM(Coulter公司，美国)。

1.2 星形胶质细胞原代培养出生2～3 d Wistar大鼠麻醉后，解剖显微镜下取T11～L6脊髓背角组织，加入0.25%胰蛋白酶置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中消化30 min，将细胞悬液接种于培养瓶内（细胞培养基为含10%胎牛血清和5%小牛血清和0.3%葡萄糖的DMEM/F12），培养7～9 d后置于180转/min恒温摇床上摇15 h，将其传代接种在24 孔培养板中，细胞接种密度为5×106/ml，3～7 d后通过细胞鉴定即可用于实验。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞为星形胶质细胞。

1.3 实验分组将培养细胞随机分为6组，每组8 孔细胞：对照组（C组）加入Hanks液50 μL，谷氨酸组（G组）加入谷氨酸至终浓度100 μmol/L；氯胺酮组(K组)加入氯胺酮至终浓度100 μmol/L；GK1、GK2、GK3组先加入谷氨酸至终浓度100 μmol/L，30 min后分别加入氯胺酮至终浓度10、50、100 μmol/L。谷氨酸和氯胺酮均用Hanks液进行稀释，加入药物后各孔培养基体积均为1.55 ml。细胞培养30 min或48 h后用于实验。

1.4 流式细胞仪检测星形胶质细胞内游离钙浓度加药后各组细胞培养30 min，去培养基，用PBS洗2次，0.125%胰蛋白酶消化5 min；待细胞收缩变圆后，用无钙缓冲液PBS终止消化并制成细胞悬液；低速离心（500 rpm，5 min），弃去上清液，再用PBS冲洗2次； 收集各组细胞重悬于PBS中，调整细胞密度为5×105个/ml；取上述细胞悬液1 ml加入Fluo3—AM至终浓度为10 μmol/L，置CO2培养箱孵育1 h(37 ℃，避光)，其间轻轻振荡几次；取出细胞悬液离心，再用无钙PBS反复洗涤3次，去除多余染料；再用PBS重悬至1 ml，于流式细胞仪检测，激发波长为506 nm，发射波长为526 nm；随机测定单个星形胶质细胞的荧光强度值，取1万个细胞的荧光强度值的平均值为各组测定值。

1.5 流式细胞仪检测凋亡细胞数加药后各组细胞培养48 h后，弃培养基，PBS冲洗2次，0.125%胰蛋白酶消化，收集1×106个细胞，1 ml PBS重悬，300目尼龙网过滤后离心（1 000 rpm，5 min），弃上清，应用DNA流式检测试剂盒检测凋亡细胞数。

1.6 统计学处理用SPSS10.0软件进行统计处理，计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析,P0.05为差异有统计学意义。