SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究
作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中。
Blocking effect of vectorbased siRNA on stathmin gene expression in human HeLa cells。
【Abstract】 AIM: To explore the blocking effect of siRNA on the expression of stathmin gene in HeLa cell line using siRNA eukaryotic expression vector. METHODS: Two stathmin siRNA cDNAs were synthesized according to the stathmin gene sequence and cloned into the vector pSilencer4.1CMVneo and named pSilencerS1 and pSilencerS2 respectively, which were further identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing. HeLa cells were then transfected with pSilencerS1 and pSilencerS2. After G418 selection, the cells were selected and the interfering effect was detected by RTPCR. RESULTS: Restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing results showed that the 2 target segments were cloned into pSilencer4.1CMV neo vector respectively. The results of RTPCR indicated that both siRNA vectors could successfully knock down stathmin gene expression. CONCLUSION: The vectorbased siRNA on stathmin gene can effectively knock down stathmin gene expression, which has the potential of being applied in gene therapy against malignant tumors.
【Keywords】 stathmin; RNA, small interfering; eukaryotic expression vector; HeLa cells。
【摘要】 目的： 构建人stathmin基因的siRNA真核表达载体，探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用. 方法： 将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体，酶切及测序鉴定. 脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞，G418筛选后RTPCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果. 结果： 经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体. 经脂质体转染HeLa细胞后，RTPCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低. 结论： 成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用. 【关键词】 stathmin； RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa细胞。
0引言。
Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明［1，2］通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转. 因此，stathmin是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点. RNA干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内mRNA, 使基因转录后沉默. 许多学者［3—5］认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破. 本试验通过构建针对stathmin基因的siRNA真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.
1材料和方法。
1.1材料。
质粒提取试剂盒（Wizard plus Minipreps DNA Purification System）, pGEMTeasy 载体连接试剂盒，逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司. pSilencer4.1CMV neo载体及阴性对照pSilencer4.1CMV neo negtive control为 Ambion公司产品. 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ为Takara公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司. TaqDNA聚合酶，DGL2000DNA Marker及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司. HeLa细胞及宿主菌株大肠杆菌JM109为本实验室保存.
1.2方法 1.2.1针对stathmin基因的siRNA cDNA设计和制备根据GenBank中stathmin基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段19nt(分别位于基因序列中：398417;540559)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析. 根据RNA干涉载体pSilencer4.1CMV neo的要求分别于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点. 每段各设计一对55个碱基的序列，由博亚生物技术有限公司合成. 两对stathmin基因的siRNA cDNA序列如下： 5′GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAA TTCAAGAGA TTTCTCGTGCTCTCGTTTCAGAAGCTT3′，互补链为： 5′AAGCTTCTGAAACGAGAGCACGAGAAA TCTCTTGAATTTCTCGTGCTCTCGTTTCGGATCC3′；另一对为：5′GGATCCCGTTTGCGAGAGAAGGATA TTCAAGAGATATCCTTCTCTCGCAAACGAGAAGCTT3′,互补链： 5′AAGCTTCTCGTTTGCGAGAGAAGGATATCTCTTGAATATCCTTCTCTCGCAAACGGGATCC3′. 斜体部分为siRNA cDNA序列，中间为Loop.
1.2.2构建siRNA的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体将合成的互补链分别退火，形成带有粘端的双链，用T4连接酶分别连接入线性化的pSilencer4.1CMV neo载体中BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间. 转化Jm109大肠杆菌，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定. 酶切鉴定正确的克隆送上海基康公司测序，分别命名为pSilencerS1和pSilencerS2.