雷公藤内酯与CsA联合抗大鼠异种角膜移植排斥
【摘要】 目的 我们用大鼠异种穿透性角膜移植的动物模型，来研究雷公藤内酯与CsA联合抗移植排斥的效果。方法 我们用豚鼠角膜对Wistar大鼠实施异种穿透性角膜移植术，分别用雷公藤内酯按100μg/kg体重; CsA注射液按15mg/kg体重；雷公藤内酯和CsA注射液联合用药（100μg/kg+10mg/kg）组抗移植排斥反应。根据Holland等建立的临床观察评分法和免疫组化观察疗效。结果 (1)临床观察结果表明，CsA和雷公藤内酯联合用药抗排斥作用优于单独给药（P＜0.01）。(2)观察外周血T细胞亚群的变化发现CD8+细胞的百分数变化联合用药组明显低于CsA或雷公藤单独给药组，CsA组和联合用药组的IL—2R+细胞百分数变化明显低于雷公藤内酯，它们的差别均有统计学意义（P＜0.05）。(3)角膜移植后15天联合用药组植片中淋巴细胞浸润最轻。结论 雷公藤内酯和CsA具有协同抗移植排斥作用。
Combination therapy of triptolide and cyclosporine A resist xenocorneal transplant rejection。
【Abstract】 Objective A xencorneal penetrating keratoplasty model was established in Wistar rat and investigated the effect of anti—rejection by combination therapy under CsA and triptolide. Methods After the corneal of Guinea—pig was transplanted into the eye of Wistar rat， we injected 100μg/kg body weight of triptolide， 15mg/kg body weight of CsA and 100μg/kg + 10mg/kg of triptolide and CsA for anti—rejection. The observations on the effect of different anti—rejection agents base the method of Holland and immunochemistry. Results (1)Clinical observation had shown more long—term survival in xenocorneal recipients with combination therapy than triptolide or CsA separating therapy. (2)The changes of percent of CD8+ cell in combination therapy group was less than other therapy groups and percent of IL—2R+ cell in combination therapy group and CsA group was less than triptolide group(P＜0.05).(3)15 days after keratoplasty， there were a few lymphocytes infiltrating the graft cornea in combination therapy group and excel other therapy groups.Conclusion Tiptolide and CsA have a synergetic effect on preventing and treating transplant rejection.
【Key words】 triptolide；CsA；transplant rejection；keratoplasty。
历史上，因移植角膜的特惠性生存使眼部被视为具有免疫赦免性的器官之一。最近的研究表明，角膜具有和机体其它器官相似的免疫成分和免疫体系，角膜的免疫赦免是相对的。角膜移植术后，排斥反应的发生率仍为10%～65%，因此和其它组织、器官移植一样，角膜移植排斥是角膜移植术后继发移植失败的最常见的原因，而且有着与前者相似的排斥机制［1］。即：(1)创伤修复和炎症期；(2)移植抗原致敏期；(3)激活免疫活性细胞；(4)移植物（植片）受损期。我们应用大鼠异种穿透性角膜移植的动物模型，研究雷公藤内酯与环孢素A（cyclosporin A，CsA）联合用药抗移植排斥的效果。
1 材料。
1.1 实验动物 Wistar 大鼠2～3月龄，180～220g，雄性18只，豚鼠（英国种短毛）2～3月龄，200～230g，雄性9只。由第一军医大学动物实验中心提供，清洁级。
1.2 免疫组化试剂 小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX—8)，MaR Ia(OX—6)，MaR IL—2R(ART—18），MaR WBC(W 6/32)均由军事医学科学院进口分装。ABC显色试剂盒为Dako公司产品。
1.3 抗排斥药物 雷公藤内酯注射液为福建省药物研究所提供，CsA注射液为瑞士SANDOZ公司产品。
2 方法。
2.1 大鼠异种穿透性角膜移植术（右眼） (1)麻醉：2%戊巴比妥钠按1mg/kg腹腔内注射，0.5%地卡因眼液点术眼，2%普鲁卡因0.2ml球后注射。（2）植片制作：豚鼠处死后，0.8%庆大霉素眼液冲洗结膜囊，沿角膜巩缘剪下角膜，以直径4.5mm环钻从内皮面压切成植片。（3）角膜移植：以直径4mm环钻，钻切角膜大深层，以尖刀挑穿后沿钻切口剪下角膜，将植片放置于植床上，11—0尼龙线间断缝合12针，复方NaCl注射液注入形成前房，四环素眼膏涂眼。
2.2 雷公藤内酯、CsA注射液的使用 雷公藤内酯按100μg/kg体重; CsA注射液按15mg/kg体重；雷公藤内酯和CsA注射液联合用药，雷公藤内酯仍按100μg/kg体重，CsA注射液按10mg/kg体重给药，上述各组均每日腹腔注射给药1次。
2.3 临床观察 根据Holland等建立的临床观察评分法［2］，观察得分值为RV(rejection value)，计分标准如下：（1）透明度：0，清亮;1，轻度浑浊；2，浑浊加重，前房清楚可见；3浑浊加重，前房模糊可见；4，全浑浊，前房看不清。（2）水肿： 0，无基质水肿或上皮水肿；1，轻度基质增厚；2，弥漫性基质水肿；3，弥漫性基质水肿合并上皮Microcytic水肿；4，大疱性角膜病变。（3）新生血管： 0，无；1，周边新生血管；2，切口部新生血管；3，植片部新生血管；4，全角膜新生血管。Opton裂隙灯显微镜观察，每隔3天计分一次，动态观察30天。
2.4 免疫组化观察 （1）角膜移植术后第6天、第10天和第15天各组各取1只鼠角膜移植眼球做冰冻切片及免疫组化，方法：①在冰冻切片机中切片。②切片置于0.03%H2O2甲醇中放入真空箱内，在66.7kPa负压下持续10min。③自来水洗，0.01mol/L pH7.2 PBS洗3次，共3min。④加入正常马血清，同②处理。⑤直接分别加入小鼠抗大鼠T淋巴细胞亚群W/OX系列单克隆抗体MaRTh/i(W3/5)，MaRTc/s(OX—8)，MaR Ia(OX—6)，MaR IL—2R(ART—18），和MaR WBC(W6/32)。⑥PBS洗3次同③。⑦加入生物素化羊抗小鼠二抗（1：600），同③。⑧PBS洗3次，DAB显色，HE复染。（2）外周血淋巴细胞亚群分析：2%戊巴比妥钠麻醉Wistar大鼠，心内穿刺取血1.5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液离心（1500r/min，15min）分离淋巴细胞，RPMI1640离心洗3次，调整淋巴细胞悬液浓度为1×105个/ml，取0.1ml涂片，吹干，用丙酮固定1min，PBS洗片。同（1）法作免疫组化。动态观察术前3天，术后3天、9天、15天、21天和30天。
2.5 统计学分析 所有实验数据均用±s表示，用SPSS11.0统计软件作Student—Newman—Keuls test(SNK)分析，两样本均数间进一步作Student’s T—test，分析，P＜0.05为差别有统计学意义。
3 结果。
3.1 角膜移植术后的临床观察 动态观察各治疗组间RV变化，随着时间的推移治疗组RV曲线上升趋势比对照组要缓慢，而CsA和雷公藤内酯联合用药组RV曲线上升的最为缓慢（图1）。以RV7时为发生严重排斥反应的标准，观察对照组发生严重排斥反应的时间为(13.1±1.5)天，而各治疗组达到此RV时间明显长于对照组（P＜0.01），差别有统计学意义。CsA(10mg/kg)和雷公藤内酯(100μg/kg)联合用药抗排斥作用要优于同等剂量的单独给药（P＜0.01），见表1。