柔肝消癥饮对肝硬化大鼠肝细胞转化生长因子β1表达的影响
作者：杨牧祥 于文涛 王少贤 张。
【摘要】 目的 观察柔肝消癥饮对肝硬化大鼠转化生长因子(TGF)β1表达的影响。方法 以复方鳖甲软肝片为对照，观察柔肝消癥饮对肝硬化大鼠肝组织病理形态学和肝细胞TGFβ1表达的影响。结果 与正常组比较，模型组大鼠出现肝小叶损害，纤维组织增生，假小叶形成，肝细胞TGFβ1表达明显增强(P0.01);与模型组比较，各治疗组肝脏病理损害较轻，肝细胞TGFβ1表达减少(P0.01)。结论 柔肝消癥饮能显著抑制肝硬化模型大鼠肝细胞TGFβ1表达，具有抑制细胞外基质合成、抗肝硬化的作用。
【Abstract】 Objective To observe the effect of Rouganxiaozheng liquid on expression of TGFβ1 in hepatic cells of cirrhosis rats. Methods Fufangbiejiaruangan tablet was selected as control and the effect of Rouganxiaozheng liquid on hepatic sclerosis was evaluated by observing the change of pathological hepatic tissue and the expression of TGFβ1 in hepatic cells. Results Compared with normal group, the normal hepatic lobules in model group were disappeared and fibroplasias and pseudolobule formed. The expression of TGFβ1 in hepatic cells were increased obviously(P0.01). Compared with model group, the change of pathological histology of each treatment group was improved, the expression of TGFβ1 of each treatment group was decreased evidently(P0.01). Conclusions Rouganxiaozheng liquid has the effect of inhibiting the synthesis of extracellular matrix and hepatocirrhosis and can obviously decrease the expression of TGFβ1 in hepatic cells of cirrhosis rats.
【Key words】 Rouganxiaozheng liquid; Hepatic cirrhosis; TGFβ1。
肝硬化是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害，是我国常见疾病和主要死亡病因之一〔1〕。目前国内外尚缺乏有效的治疗药物。柔肝消癥饮为本课题组经多年临床观察筛选的治疗肝硬化有效方药，为了探讨其作用机制，本研究观察了该药对肝硬化大鼠转化生长因子(TGF)β1表达的影响。
1 材料与方法。
1.1 材料。
1.1.1 动物 清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体重180～200 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2004007。
1.1.2 药物 柔肝消癥饮：由香附、青皮、炙黄芪、炒白术、白芍、三棱、莪术、地鳖虫、郁金、姜黄、丹参等药物组成，水煎浓缩成所需含量的药液。复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司)0.5 g/片，批准文号：国药准字Z19991011。
1.1.3 主要试剂 TGFβ1免疫组织化学试剂盒购自Santa Cruz，批号：sc146。
1.1.4 主要仪器 HHW21600型电热恒温水箱，天津泰斯特仪器有限公司;OLYMPUS BX51型显微照相仪，日本;LEICA RM2125型切片机，德国LEICA公司。
1.2 方法。
1.2.1 模型制备 60只大鼠适应性喂养1 w，随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献〔2，3〕，48只造模组大鼠首次予皮下注射40% 四氯化碳花生油溶液0.5 ml/100 g体重，以后每周2次皮下注射0.3 ml/100 g体重，共9 w。造模开始前2 w均以20%猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料(河北医科大学动物实验中心加工)喂养，第3～9周以0.5% 胆固醇和99.5% 玉米面混合饲料(河北医科大学动物实验中心加工)喂养。整个造模期间以30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9 w末确认造模成功后予以分组治疗。
1.2.2 分组与治疗 造模结束后，正常组随机抽取大鼠10只，将造模成功大鼠随机抽取40只，再分为4组，每组10 只，雌雄各半。各组用药如下：①正常组：灌服生理盐水;②模型组：灌服生理盐水;③柔肝消癥高剂量组(简称高剂量组)：每日予柔肝消癥2.5 g/100 g体重;④柔肝消癥低剂量组(简称低剂量组)：每日予柔肝消癥1.25 g/100 g体重;⑤复方鳖甲软肝片对照组(简称对照组)：每日予复方鳖甲软肝片0.056 g/100 g体重。各治疗组均将药物配制成所需浓度，1次/d灌胃，每次用药体积均按1 ml/100 g计算，共4 w。
1.2.3 动物取材 治疗结束后，用10%水合氯醛(0.2 ml/kg)将大鼠麻醉，腹部正中切口，迅速剖取肝脏，用滤纸吸去表面液体，在肝脏最大叶距边缘约0.5 cm处取1 cm3大小组织块，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，采用HE和免疫组化SP法染色。
1.2.4 检测指标 免疫组化光镜下TGFβ1阳性表达为棕黄色颗粒。采用HPIAS1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统9.0版对染色阳性部位进行光密度值测定。定量分析TGFβ1阳性表达的面数密度(Na)(测量窗口中阳性细胞数目/参考面积，表示参照系单位体积中阳性细胞的数目)，比表面(Sv)(阳性表达总周长/参考面积，反映参照体积中阳性细胞面积所占的相对比例)，体积百分数(Vv)、面积百分数(Aa)(阳性表达总面积/参考面积，反映单位面积内阳性表达面积所占的比值)，平均灰度(反映肝细胞中阳性细胞表达强度)。
1.3 统计学处理 计量数据采用x±s表示，运用SPSS11.5统计软件，采用方差分析、Student NewmanKeul检验。
2 结 果。
2.1 各组大鼠肝细胞TGFβ1的定量表达 模型组大鼠肝细胞TGFβ1Na、Sv、Vv和平均灰度均较正常组明显升高(P0.01);用药治疗后，各用药组TGFβ1阳性表达参数均较模型组明显下降(P0.01)。其中，高剂量组TGFβ1Na较对照组明显下降(P0.05)。见表1。表1 各组大鼠肝细胞TGFβ1的定量表达与模型组比较：1)P0.01;与对照组比较：2)P0.05。
2.2 光镜观察 见图1。正常组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列规则成索状，在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰，无异常改变。肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常。模型组大鼠肝小叶正常结构消失，间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大，局部肝细胞出现严重的脂肪变性，可见到再生的肝细胞(双核)。肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团(即假小叶形成)。高剂量组肝小叶结构亦受损，少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞，较少炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。低剂量组肝小叶结构被破坏，部分肝细胞气泡样变性并伴有细胞坏死，较多淋巴、单核细胞浸润，纤维组织增生，但较少形成间隔。对照组与低剂量组基本相似。
2.3 各组大鼠TGFβ1的定性表达 TGFβ1在正常肝细胞中有少量表达，有少量胞核和胞浆染色阳性。造模以后大鼠肝细胞TGFβ1表达量明显增强、阳性染色细胞数目增多，呈棕黄色胞浆型分布，主要见于星状细胞、类间质细胞和炎细胞胞浆中。见图2。各治疗组阳性染色程度较模型组明显减轻，在纤维隔内间质细胞和炎细胞胞浆阳性染色程度减轻、数目减少。