抑癌基因fhit及凋亡抑制蛋白survivin在宫颈鳞状细胞癌的表达及意
作者：李鲁宏， 张白凌， 张鹏飞。
【关键词】 ,宫颈肿瘤；,癌,鳞状细胞；,基因,肿瘤抑制；,微管相关蛋白质类；,组氨酸；,免疫组织化学。
摘要: 目的 探讨抑癌基因fhit和凋亡抑制蛋白survivin在宫颈鳞状细胞癌（鳞癌）及宫颈上皮内瘤变（CIN）的表达与意义及其相关性。 方法 采用免疫组织化学技术（SP法）检测82例宫颈鳞癌和40例CIN以及20例慢性宫颈炎中fhit蛋白和survivin蛋白的表达，并结合临床病理特征进行分析。 结果 （1）fhit基因在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为32%，与慢性宫颈炎及CIN的差别有统计学意义（P0.01），与宫颈鳞癌的病理分级（G1～3）、临床分期（Ⅰ～Ⅲ）、患者年龄和有无淋巴转移无关（P0.05）。（2）survivin蛋白在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为69.51%，与慢性宫颈炎及CIN的差别有统计学意义（P0.01），并随宫颈鳞癌的临床分期（Ⅰ～Ⅲ）递增（P0.05），而且与患者年龄、有无淋巴转移有关（P0.05），与病理分级无关（P0.05）。（3）fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导在宫颈癌组织中的表达呈低度相关（P0.05）。 结论 fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导在宫颈鳞癌的发生发展中起重要作用，可能为宫颈鳞癌的诊疗提供新的靶点。
脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad，fhit）是1996年发现的一个新的抑癌基因，成为肿瘤发生及肿瘤特异性基因研究的热点[1]。survivin基因是近年来发现的一个调节细胞程序性死亡（即凋亡）的蛋白质家族IAPS（inhibitor of apoptosis proteins）8个成员中的一个，是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一[2]。两种基因均与肿瘤的发生、发展和预后相关。 子宫颈鳞状细胞癌（宫颈鳞癌）是子宫颈癌组织分类中最常见的一种，占95%左右。近年来，其发病率呈快速增长趋势。虽然，外科手术技巧的提高、放疗及免疫治疗技术的进步使子宫颈癌患者的总体生存率得到了很大的提高，但术后复发及转移、早期诊断困难等影响总体生存率的主要问题仍然突出。研究表明，fhit基因及survivin基因分别异常表达于人类恶性肿瘤如头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌和胃癌等鳞状癌细胞株中。笔者采用免疫组织化学（SP法）检测fhit、survivin在宫颈鳞癌中的表达情况，探讨它们与宫颈鳞癌发生、发展及病理分期、组织学分级的关系及相关性。
1 材料与方法。
1.1 材料 收集福建医科大学附属第二医院20012004年原发性宫颈鳞癌手术切除标本82例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）40例，慢性宫颈炎20例。入选患者术前未接受化疗、放疗及免疫治疗，均具有完整的临床与病理数据。
1.2 分组 （1）宫颈鳞癌组：82例宫颈鳞癌患者，中位年龄48.14岁（26～68岁），其中45岁40例，≤45岁42例。所有病例均经病理诊断复检核实。按1995年国际妇产联盟（FIGO）分类标准划分为：①临床分期：Ⅰ期组50例，Ⅱ期组18例，Ⅲ期组14例；②病理分级：G1组19例，G2组37例，G3组26例；③淋巴结转移：转移组（N1）26例，无转移组（N0）56例。（2）40例CIN患者分3组：Ⅰ、Ⅱ级组各15例，Ⅲ级组10例。（3）选取20例经病理检查确认为慢性宫颈炎的组织作为对照。
1.3 试剂 浓缩型兔抗人fhit多克隆抗体（ZA0410）、浓缩型兔抗人survivin多克隆抗体（RAB0536）为美国Santa Cruz公司产品，购自北京中山生物技术有限公司；SP免疫组织化学超敏染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。
1.4 实验方法 采用SP法检测标本中fhit和survivin的表达情况，具体步骤按SP试剂盒说明书进行。
1.5 结果判断 fhit、survivin染色阳性表达判定标准：每张切片随机选择具有代表性的10个400倍视野进行观察计数，每个视野计数100个肿瘤细胞。fhit参照文献[3]，survivin参照文献[4]，均采用半定量积分法，对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级记分，然后根据两项之积定其阳性强度。fhit阳性以细胞质呈现棕黄色颗料状染色为主。染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分；阳性细胞百分比：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积1～2分为阴性，≥3分为阳性。survivin阳性以细胞核或细胞质呈现棕黄色颗料状染色为标准。计算阳性细胞百分率：A 0～25%；B 26%～50%；C 51%～75%；D75%。肿瘤显色深浅按：（a）阳性细胞呈淡黄色云雾状为1分；（b）阳性细胞呈黄色颗粒状为2分；（c）阳性细胞呈深黄色为3分。计算两者乘积，以得分≤1分为阴性，1分为阳性。
1.6 统计学处理 数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析。fhit与survivin表达宫颈鳞癌临床病理学指标的相关性分析采用ChiSquare检验，指标间相关分析采用Kappa法一致性检验。P0.05表示差别有统计学意义。
2 结果。
2.1 fhit在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌的表达 正常宫颈鳞状上皮、宫颈内膜腺上皮及肿瘤间质细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及浆细胞等均呈中强着色，细胞核未见表达。82例宫颈鳞癌中，26例阳性表达，阳性率31.71%；20例慢性宫颈炎组织中，17例阳性表达，阳性率85%；40例CIN患者中，30例阳性表达，阳性率80%。fhit在宫颈鳞癌的表达明显低于慢性宫颈炎组和CIN组，差别有统计学意义（P0.05)；后两者比较差别无统计学意义（P0.05）。
2.2 survivin在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌的表达 survivin基因表达阳性染色部位主要在肿瘤细胞核中，表现为粗细不一的棕黄色颗粒，也有的呈弥漫性细胞质染色（图1）。82例宫颈鳞癌中，57例阳性表达，阳性率69.51%；20例慢性宫颈炎组织中，3例阳性表达，阳性率15%；40例CIN中，12例阳性表达，阳性率30%。survivin在宫颈鳞癌中的表达明显高于在慢性宫颈炎和CIN中的表达，差别有统计学意义（P0.05)。
2.3 fhit与survivin的表达和宫颈鳞癌临床病理学指标的关系见表1。
2.4 宫颈鳞癌组织fhit、survivin表达的相关性 fhit基因表达阳性及阴性者中survivin蛋白阳性表达率分别为7.69 %，98.21%，两者比较，差别有统计学意义（χ2=68.654，P0.01)，即癌组织中fhit基因的失活与survivin表达上调显著相关。对82例宫颈鳞癌组织中fhit及survivin蛋白表达强度评分进行等级相关分析，fhit蛋白的阴性水平与survivin的阳性表达水平呈低度相关（Kappa=0.496，P0.05)。
A:细胞质阳性表达，呈棕黄色颗粒状；B:细胞核阳性表达，呈棕黄色颗粒状.
图1 fhit及survivin在宫颈鳞癌组织中的表达（SP染色 ×400）（略）。
Fig 1 Express of fhit and survivin in cervical carcinomas。
表1 fhit与survivin表达和宫颈鳞癌临床病理学指标的关系（略）。
Tab 1 Relationship between expression of fhit and survivin and clinical and pathological features in patients with cervical carcinoma。
表中数据为例数（%）. fhit：脆性组氨酸三联体； survivin：凋亡抑制蛋白. 组内比较，☆：P0.05，☆☆：P0.01.
3 讨论。
3.1 fhit在宫颈鳞癌中的表达 fhit基因定位于宫颈鳞癌等位基因缺失高发区3P14.2内，被认为与人类多种恶性肿瘤的发生关系密切。它所编码的蛋白是fhit蛋白，在人体所有正常组织中均有表达，在体内的具体功能还不十分清楚。已知fhit蛋白是一种典型的腺苷三磷水解酶（dinucleoside 5’5”P1,P3triphosphate hydrolase AP3A)[5]。AP3A是ATP类似物，能抑制蛋白激酶的活性，其水平升高可增强生长信号传导途径，阻断抑制途径或凋亡通道，导致肿瘤的产生，而fhit蛋白能作用于mRNA帽类似物，影响重要基因mRNA的翻译，脱帽功能的丧失也可能引起肿瘤。 研究表明，fhit蛋白的C末端部分与酵母泛素结合酶9相互作用，参与S期及M期细胞周期蛋白的降解，进一步调控细胞周期[6]。Ishii等将fhit基因导入7个食管癌细胞系（其中的5个不表达内源性fhit蛋白），结果有2个细胞系发生了明显的凋亡（TE4和TE14），同样，在低水平表达内源性fhit蛋白的Hela细胞系中也有类似的现象[7]。Hendricks采用RTPCR技术对8个宫颈鳞癌细胞系进行了研究，发现63%的细胞系可检测到异常fhit转录产物，这与食管癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤观察到的改变类似[8]。Greenspan等亦发现6/7宫颈鳞癌细胞系和68%原发性宫颈鳞癌检测不到fhit转录产物或检测到异常产物，而相应在正常宫颈上皮则表现为fhit的强表达[9]。 笔者实验结果显示，fhit蛋白在宫颈鳞癌中的阳性表达率为32%，明显低于慢性宫颈炎组织（85%）（P0.05）；其阴性表达率为68.2%，介于Greenspan等报道的76%与Birrer等报道61%之间[910]，提示fhit基因表达下降，对宫颈鳞癌的发生起了重要作用。同时还发现随着肿瘤分化程度的降低、临床分期的进展变化，fhit蛋白的表达水平差别无显著性。实验结果还显示，宫颈鳞癌中fhit的表达与患者的年龄及有无淋巴结转移无关（P0.05），支持Nakagawa等关于fhit异常表达并非宫颈鳞癌进展结果的推论[11]。