武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型分析

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【摘要】目的：了解武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）基因型的分布情况。方法：取妇女宫颈的脱落细胞，利用基因芯片技术检测18种高危型HPV和5种低危型HPV。结果：总共检测606例，HPV总共感染391例，感染率64.5%。高危型HPV感染274例，感染率45.2%；高危型HPV感染率排在前5位的依次是HPV 16（24.6%）、HPV 18（10.4%）、HPV 58（5.3%）、HPV 33（2.8%）、HPV 56（1.5%）。仅感染低危型HPV为117例，感染率为19.3%。单一基因型感染332例，占感染人数的84.9%；两重感染53例，占感染人数的13.6%；三重感染6例，占感染人数的1.5%。结论：武汉地区妇女宫颈HPV感染率较高，主要为单一基因型感染；高危型HPV主要是HPV16和18，其次是HPV 58、33、56。

【关键词】宫颈；人乳头瘤病毒；基因型。

Analysis of Human Papillomavirus Genotype Distribution in Cervical Lesion of Women in Wuhan。

HU Xingwen。

(Maternal and Child Health Hospital of Hubei, Wuhan, Hubei 430070, China)。

Abstract: Objective To investigate human papillomavirus (HPV) genotype distribution in cervical lesion of women in Wuhan. Methods 18 highrisk HPV(hrHPV) genotypes and 5 lowrisk HPV(lrHPV) genotypes in cervical lesion of women were detected by gene chip techniqe. Results Of 606 cases were detected, 391 cases were HPV positive (64.5%). 274 cases were hrHPV positive (45.2%). 117 cases were only lrHPV positive (19.3%). Among hrHPV infection, HPV16 was the most common genotype (24.6%), followed by HPV18 (10.4%), HPV58 (5.3%), HPV33 (2.8%), and HPV56 (1.5%) respectively. Among HPV infection cases, 332 cases were single HPV infection (84.9%), 53 cases were double HPV infection (13.6%), and 6 cases were triple HPV infection (1.5%). Conclusion HPV infection in cervical lesion of women was severe in Wuhan. Most of them were single HPV infection. HPV16 was the most common genotype, followed by HPV 18, HPV 58, HPV 33, and HPV 56.

Key words: Cervical; Human papillomavirus; Genotype 　　宫颈癌是全世界妇女第二位最容易发生的癌症，每年新诊断出约470 000例，每年死亡人数达250 000［1］。HPV是宫颈癌发展的必要因素［2～5］。在感染人类的人乳头瘤病毒(HPV)中，已经测定基因序列的有100多种基因型［6］。在全世界，不同的地域，HPV流行的基因型有所差异，了解武汉地区妇女宫颈感染的HPV基因型分布情况，对监控HPV感染疫情和将来使用HPV疫苗来预防宫颈癌的发生有很重要的指导意义。

1 材料和方法。

1.1 材料。

1.1.1 研究对象 606例标本来自我院妇科门诊2005年1月至2006年12月诊断为宫颈上皮内瘤样变（cervical intraepithelial neoplasia CIN）Ⅰ级以上的患者，年龄16岁～60岁，平均年龄(31.5±8.2)岁。

1.1.2 试剂和仪器 HPV分型基因芯片检测系统(亚能生物技术有限公司, 深圳)； Biometra基因扩增仪(德国)，FYY3型分子杂交仪(江苏兴化分析仪器厂)。显色液须新鲜配制, 按顺序加入以下溶液: C 液(0.1 mol/L 柠檬酸钠, pH 5.4)19 ml, 四甲基联苯胺1 ml, 体积分数3%H2O2 10 μl。20 倍SSC, 质量分数10%的十二烷基硫酸钠(SDS)、1 mol/L 柠檬酸钠均为深圳亚能生物技术有限公司提供, 用时按所需浓度加蒸馏水配制。

1.2 方法。

1.2.1 标本的采集及保存方法用专用毛刷, 紧贴宫颈口黏膜, 稍用力转动2周, 以取得脱落细胞，将取样后的毛刷放入备有1 ml无菌生理盐水的试管中, 充分漂洗后将毛刷贴壁挤干丢弃。采集的样本没有及时检测时则放在—20 ℃保存。

1.2.2 样本处理方法将漂洗过毛刷的生理盐水全部转移到1.5 ml离心管中,13 000 r/min离心10 min, 弃去上清, 保留管底的细胞块。加入50 μl裂解液充分混合,100 ℃加热10 min。13 000 r/min离心10 min, 保留上清待用。

1.2.3 HPV基因芯片检测 PCR扩增取PCR反应管一支,做好标记,于5 000 r/min离心2 s, 加入已提取的待测样品DNA 5 μl, 反应总体系为25 μl。每次实验设置一个阴性对照, 即以5 μl无菌纯水为模板。扩增条件:50 ℃,15 min；95 ℃,10 min；而后循环40次(94 ℃,30 s；42 ℃,90 s；72 ℃,30 s)；72 ℃延伸5 min。杂交及洗膜取固定有23种HPV分型探针的膜条放入塑料离心管,加入A液(2SSC)及PCR产物,将塑料管放入沸水中加热10 min后,放入杂交箱51 ℃杂交1 h。于51 ℃轻摇洗涤15 min。膜条转移至已于杂交箱中预热到51 ℃的40 ml B 液(0.5 SSC)管中, 轻摇洗涤15 min,弃液体。显色膜条置于POD溶液室温轻摇浸泡30 min,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗2次,5 min/次。用C液室温洗膜1 min～2 min,将膜条浸泡于显色液中避光10 min左右即可见斑点显现, 若显色液较弱可适当延长显色时间, 显色完毕将膜条浸泡在水中清洗, 最后取出膜条于4 ℃保存。结果判定作为阴性对照的杂交膜条会在PC位置出现蓝色斑点, 同时其他位点不应该显色；检测用的每张膜条在PC处均应有蓝色斑点出现, 此时结果的判读视为有效。膜条上的探针排列顺序HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、44、59、66、68、73、83、MM 4、PC。由斑点显现的位置即可断定HPV 的基因型。其中, 低危型: HPV 6、11、42、43、44。其他为高危型: HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM 4。

2 结果。

总共检测606例，HPV总感染例数391例，感染率为64.5%。检出的基因型有低危型HPV 6、11、42和高危型HPV 16、18、31、33、35、45、53、56、58、59、68、73，见表1。未检出的基因型有低危型HPV 43、44和高危型HPV 39、51、52、66、83、MM 4。高危型HPV感染人数274例，感染率为45.2%，在高危型基因型中，HPV 16和18共占71.9%，其他基因型共占28.1%，感染率排在前5位的依次是HPV 16、18、58、33、56。仅感染低危型HPV为117例，感染率为19.3%。单一基因型感染332例，占感染人数的84.9%。两重感染53例，占感染人数的13.6%，其中，高危型和低危型混合感染32例，占两重感染的60.4%；两者均为高危型感染18例，占两重感染的34.0%；两者均为低危型感染3例，占两重感染的5.6%，见表2。三重感染6例，占感染人数的1.5%，其中高危型和低危型混合感染5例，三者均为高危型感染1例，见表3。

表1 HPV基因型的分布（略）。

表2 HPV两重感染基因型分布（略）。

表3 HPV三重感染基因型分布（略）。

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