东亚钳蝎提取物对癫痫小鼠大脑皮层NMDA受体和GABAA受体的调节作

【关键词】 东亚钳蝎提取物；,,GABAA受体；,,NMDA受体；,,癫痫 论文网。

摘要：目的 研究 BmKE对抗戊四氮致癫痫作用及其对致痫小鼠大脑皮层NMDAR和GABAAR的调节作用。 方法 观察戊四氮（PTZ）致癫痫模型小鼠，丙戊酸钠（VAP，阳性对照） 治疗 组和BmKE低（L）、中（M）、高（H）剂量治疗组小鼠癫痫发作的潜伏期， 应用 同位素3H分别标记MK—801和Mucimol，检测小鼠大脑皮层NMDAR和GABAAR的结合活性。结果BmKE（M）能显著延长PTZ致癫痫小鼠的发作潜伏期(P＜0.05)，BmKE（L）作用很小，BmKE（H）治疗组癫痫小鼠发作潜伏期的延长值比BmKE（M）治疗组低。PTZ显著升高致痫小鼠大脑皮层的NMDAR结合活性（P＜0.05），BmKE（L）治疗组小鼠大脑皮层NMDAR结合活性降低，但是无显著性差异，BmKE（M）和BmKE（H）均极显著降低癫痫小鼠大脑皮层NMDAR结合活性（P＜0.001）。BmKE（L）和BmKE（H）显著提高GABAAR结合活性（P＜0.05），BmKE（M）极显著提高GABAAR结合活性（P＜0.001）。结论适量的BmKE能够有效治疗戊四氮引起的癫痫，显著延长癫痫小鼠的发作潜伏期，BmKE抗癫痫的作用机理，可能与其抑制NMDAR结合活性，激活GABAAR的结合活性有关。

关键词：东亚钳蝎提取物； GABAA受体； NMDA受体； 癫痫。

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The Modulation of Buthus martensic Karch Extract（BmKE）on Cerebral Cortex NMDA Receptor and GABAA Receptor in Epileptic Mice　　Abstract：ObjectiveTo study the antagonism of BmKE on epilepsy of PTZinduced epileptic mice and the modulation on NMDA receptor(NMDAR) and GABAA receptor (GABAAR) binding activities in cerebral cortex. MethodsThe convulsion latent periods of PTZinduced epileptic mice，vaproate sodium（VAP，positive control drug）treating group and BmKE（L），BmKE（M），BmKE(H) treating groups were observed. NMDAR and GABAAR binding activities of cerebral cortex were detected by isotope 3H—tagged MK—801 and mulimol respectively. ResultsBmKE(M) significantly prolonged laten periods of epileptic mice(P＜0.05), BmKE(L) had a few effect on latent periods, the prolonged value of latent periods treated by BmKE(H) was shorter than that treated by BmKE(M). PTZ significantly increased NMDAR binding activities in cerebral cortex of mice (P＜0.05). Both BmKE(M) and BmKE(H) excessively decreased those of PTZ—induced epileptic mice(p0.001),but those of BmKE(L) treated group had no significant difference with those of PTZinduced epilepsic mice. GABAAR binding activities were reduced by PTZ. (P＜0.005). BmKE(L) and BmKE(H) significantly increased those of PTZinduced epileptic mice(P＜0.05), and BmKE(M) excessively increased those of PTZinduced epileptic mice(P＜0.001).ConclusionSuitable BmKE can prolong latent periods of epilepstic mice induced by PTZ, and has an antiepileptic effect. The effects of BmKE may have relationship between the inhibition on NMDAR binding avtivities and excitation on GABAAR binding avtivities in cerebral cortex of epileptic mice.

Key words：BmKE； GABAA receptor； NMDA receptor； Convulsion latent period 　　东亚钳蝎Buthus martensic Karch是我国传统药材，中医临床用干燥全虫治疗惊风抽搐、风湿痹痛等症［1］。提取分离有效部位，进而纯化有效成分，对其进行药理活性的检测，研究其作用机理将进一步提高其临床应用价值。在实验性癫痫中，GABAAR的Cl—通道阻断剂戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）被广泛应用于诱导产生惊厥、建立癫痫动物模型。早期的研究发现，PTZ不仅具有抑制GABAA受体的效应［2，3］，连续注射还可引起NMDA受体激活，导致Ca2+向细胞内流动［4］。东亚钳蝎在中医临床上常用于同其他药物配伍，控制癫痫的发作，前期研究发现，BmKE能够延长癫痫发作的潜伏期，显著升高被戊四氮抑制的GABAAR的结合活性［5］。BmKE是否还 影响 NMDAR的结合活性，从而克服PTZ的作用而达到治疗癫痫的作用，为此，我们进一步研究了BmKE对戊四氮致痫小鼠大脑皮层NMDAR的结合活性的影响。本文中我们将讨论BmKE对癫痫小鼠大脑皮层中GABAAR和NMDAR的调节作用，以阐明BmKE抗癫痫的作用机理。 论文网。

1 材料与方法。

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1.1 动物选用健康昆明系小鼠（一级），体重（20.5±0.9）g，由 中国 医学 科学 院动物研究所提供，在 自然 光线，温度为20~25℃的饲养室喂养，自由进食水。 论文网。

1.2 药物与试剂BmKE［5］，VAP， PTZ，Sigma公司产品，同位素： 3HMucimol(GABAAR拮抗剂配基)，NEN公司，3HMK801（NMDAR拮抗剂配基）， Dupont 公司，闪烁剂：PPO, Fluka 公司（进口分装），NMDAR测定采用BECHMANL9800同位素液闪计数仪。 毕业论文。

1.3 动物分组及处理 昆明系小鼠40只，雌雄各半，适应环境3 d后随机分成5组。空白对照组服用蒸馏水0.4 ml/只/d。其余4组用于PTZ癫痫模型的建立。 论文网。

1.4 PTZ癫痫模型的建立 PTZ诱导时间均定为下午1：00 ~4：00。动物在服药前均注射PTZ50 mg/kg。建模组动物首次注射PTZ的潜伏期和发作等级无明显差异。于第2天上午9：30灌胃给药。空白对照组和癫痫模型非治疗组服用蒸馏水0.4 ml /(20 g・d)；VAP185 mg/kg，并设计了3种剂量BmKE服用组，其中低剂量250 mg/kg（BmKEL）、中剂量500 mg/kg（BmKEM）、高剂量1000 mg/mg（BmKEH），给药体积 0.4 ml，连续灌服3 d。于最后一次服药后4 h再次腹腔注射PTZ 50 mg/kg。

1.5 脑突触粗膜制备 为了探讨BmKE抗癫痫的作用机理，第2次腹腔注射PTZ50 mg/kg后，将小鼠断头取脑，制备操作在4℃下进行。称取冻存脑组织，按1∶5（w/v）比例加入预冷的 50 mmol/L pH 7.4 Tris醋酸缓冲液（TAB），在冰浴中用TEKMER组织匀浆器匀浆，用Dupont RC5加入TAB 10 ml离心（21 000 r/min，20 min）。洗涤3次，最后将沉淀悬浮于灭菌的0.32 mol/L蔗糖溶液中，—70℃冻存备用。此即突触粗膜。

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1.6 NMDAR结合实验 将突触粗膜离心洗涤1次后，用0.5 ml TAB稀释。取100 μl 突触膜稀释液，加入200 μl TAB，在非特异性结合管中加入100 μl 0. 1 mmol/L非标记的MK801和100 μl TAB，每管加入0.1 μCi 3HMK801，在30℃水浴中孵育30 min，反应结束后加入预冷的TAB5 ml，抽滤在纤维素滤膜上，并用预冷的TAB20 ml洗涤。将滤膜放入闪烁杯中，75℃左右烘烤30 min后加入甲苯闪烁液7 ml，在液体闪烁计数仪上测定cpm值，结合突触膜蛋白质浓度 计算 3HMK801结合量（以每毫克蛋白质结合的3HMK801pmol数表示）：3HMK801特异结合=（样本cpm — 非特异结合cpm）×4.926pmol/mg ptot÷总计数cpm。 论文网。

1.7 GABAAR受体结合实验 总结 合试管采用3HMucimol(1 nmol/L)在Tris柠檬酸缓冲液（TCB，pH 7.1）中与粗膜于2℃孵育30 min，非特异性结合试管另加10—4mmol/L GABA。反应结束后, 加入缓冲液洗涤，负压抽滤于纤维素膜，冲洗3遍，将该膜置于闪烁杯中，加甲苯闪烁液进行测定。特异性结合以总结合减非特异性结合得到。 代写论文。

1.8 统计方法 采用Cochran ＆ Cox 近似 t检验校正其近似临界值。数据以±s表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.005和P＜0.001为差异极显著。 论文网。

2 结果。

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2.1 BmKE对小鼠癫痫发作潜伏期的影响 采用治疗后癫痫发作潜伏期－治疗前癫痫发作潜伏期的平均值 分析 ，以说明提取物延长发作潜伏期的程度（见表1）。BmKE（L）作用很小，BmKE（M）的治疗效果非常明显（P＜0.05），同VAP相当，但是，提取物剂量的进一步增加，不仅没有增强对癫痫的治疗作用，其治疗作用反而有所下降。 论文代写。