松弛素在心血管疾病中的作用及临床治疗展望
【摘要】 简要介绍松弛素家族的成员、受体及其相关信号通路，重点回顾松弛素在心血管系统中的作用特别是其抗纤维化作用。心脏和血管是松弛素的靶器官。在临床和实验研究中，观察到松驰素在心脏病中表达上调，对机体的血流动力学和心肌肥大具有调节作用；松弛素对心肌具有一定的保护作用并可能参与心肌修复和再生，逆转心脏纤维化。进一步的研究将着重于阐明松弛素作用的确切机制，并将动物模型的研究成果应用于临床血管病的治疗。
松弛素家族松弛素是1926年Frederick Hisaw在研究妊娠期间骨盆带变化时首次发现的肽类激素之一。他发现将妊娠豚鼠或兔子的血清注入从未受孕过的豚鼠体内可引起耻骨韧带的明显松弛，因此将这种激素命名为松弛素[1]。直到上世纪70—80年代，才最终认定松弛素是一种双链蛋白质，其结构特征与胰岛素相似。目前已明确，松弛素不仅在妊娠过程中具有重要作用，而且对非妊娠动物的血管结构和功能等也可产生影响[12]。更为重要的是，松弛素可由心脏产生并通过局部受体发挥心脏保护和细胞外基质调节作用[1]。松弛素已成功地改善了多种动物模型的心脏纤维化。因而，松弛素有望可被用于人类心脏纤维化性疾病的治疗。已经证实松弛素是肽类激素家族的成员之一。在人类，这一松弛素家族由7个基因所编码, 包括松弛素基因RLN1—3以及胰岛素样基因INSL3—6。此外，这个家族中的大多数成员都可与G蛋白偶联受体(Gprotein coupled receptor, GPCR)相互作用。组成这个家族的肽还具有不同的外观表性和生理功能。除人类和大多数高级灵长类动物以外，大多物种只有两种与RLN1和RLN2相对应的松弛素基因。人类循环中的松弛素主要为RLN2的基因产物即人类松弛素2(human relaxin2)。
松弛素受体是GPCR，具有含多个亮氨酸重复序列(leurinerich repeats, LRRs)的细胞外区，故命名为LGRs [3]。最近，IUPHARNC提议可分别将LGR7、LGR8、GPCR135和CPCR142认定为松弛素家族肽类受体1—4(relaxin family peptide receptors1—4, RXFP1—4) 。研究表明，松弛素是RXFP1的相关配体。RXFP1受体是含有一个复杂外功能区的富含LRR的GPCR[34]。RXFP1 受体中的低密度脂蛋白a(lowdensity lipoprotein class a, LDLa)组件、LRR和跨膜域的外侧袢2对于该受体与配体间的结合以及信息的传递非常重要(图1)。松弛素与LRR区的结合改变了外侧区域的构象, 进而促使LDLa组件与G蛋白偶联并活化腺苷酸环化酶。目前，也只有RXFP1受体在心血管系统中的作用得到了人们较大的关注。
2.2 松弛素活化的信号通路(图2)。
通过Gs介导，松弛素可使多种靶组织细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的含量增加并进一步活化蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)。有实验表明，松弛素可以激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3 kinase, PI3K)，该作用可以部分地被百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)抑制，提示PI3K的激活是通过Gi或Go的βγ亚单位所介导。cAMP对松弛素的反应程度可被激酶Cζ(protein kinase Cζ，PKCζ)抑制剂白屈菜红碱所抑制或被PKCζ活化剂神经磷脂酶所增强。因此在PI3K介导的cAMP生成增多过程中，PKCζ是其下游信号分子之一。在一些细胞系中，松弛素刺激可引起PKCζ转位至细胞膜上，应用PKCζ的反义寡核苷酸可抑制此过程。cAMP对RXFP1受体活化的反应不仅复杂而且在一定程度上依赖于细胞的种类和研究条件。 在成纤维细胞中，松弛素可能主要是通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)发挥其生物学作用的。在人类子宫内膜间质细胞、THP1细胞、原代培养的冠状动脉和肺动脉平滑肌细胞中松弛素不影响总细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase, Erk)水平，但可迅速使Erk1/2磷酸化，而且此作用可被MAPK/Erk 激酶(MAPK/Erk kinase, MEK)抑制剂所阻断。在Hela细胞和人脐静脉内皮细胞上的实验提示，松弛素对Erk1/2的激活可能不是松弛素受体直接活化的结果[5]。有证据表明松弛素可以通过增加一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的表达和/或活性对细胞产生急、慢性作用[2]。这些作用涉及两个机制：通过G蛋白偶联受体机制激活NOSⅢ以及通过cAMP的介导诱导NOSⅡ活化。而一氧化氮(nitric oxide, NO)可以活化胞浆型鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase, GC)。
许多研究已证实心脏和血管是松弛素的靶器官。心房肌松弛素受体的密度较子宫肌层高[6]。近期的研究结果表明在大鼠[4，7]、小鼠[2]和人[4]的心房和/或心室存在RXFP1 mRNA的表达。我们也确认了RXFP1受体在心房和心室的心肌及心肌成纤维细胞上均有表达[7]。有资料证明心房中高亲和力的松弛素受体与松弛素引起的变时和变力作用有关[1] 。哺乳类动物心脏中松弛素基因的转录水平很低，在患充血性心力衰竭患者的心房和心室肌中，松弛素均可持续高表达。患者动、静脉血浆中松弛素增高了4—8倍，且循环血中松弛素的水平与心功障碍的严重性显著相关[2]，扩血管治疗同时改善机体血流动力学状态可导致循环中松弛素水平降低，故推测这些松弛素可能是由心衰患者心脏的心肌细胞和间质细胞产生[2]。与在临床研究中的发现一致，啮齿类动物心脏也可表达松弛素[78]。利用RTPCR技术，我们在小鼠心房和心室组织中检测到松弛素mRNA的表达[2，8]，在大鼠的心房和心室中只有松弛素3的基因表达。因此，心脏特别是心房不仅可以产生松弛素，同时也含有高密度的RXFP。新近的实验研究证明，心肌肥大等疾患时心脏松弛素表达增加。我们发现，慢性主动脉弓缩窄的小鼠肥大左室中松弛素的表达增加了3—5倍[未发表资料]。在异丙基肾上腺素诱导的大鼠心肌缺血损伤模型中，心肌和血浆中的松弛素水平以及心肌松弛素的mRNA表达均明显升高[9]。自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)心脏的松弛素mRNA和蛋白水平均显著升高[10]。
4.1 心脏的变力和变频效应。
一些体内、外实验证实大鼠心脏对药理剂量的松弛素具有直接的以及浓度依赖的变频和变力效应。松弛素的正性变频效应在体外灌注的完整心脏[12] 和分离所得的右房组织中已见报道，而正性变力效应在左房中可以见到[11]。在大鼠心房心肌细胞中，松弛素可以抑制外向性钾电流、延长动作电位持续时间，还可增加钙内流。在兔窦房结细胞中，松弛素可以增加动作电位的发生频率，并通过PKA依赖的方式增加L样钙电流。松弛素的这些心脏作用仅限于啮齿类动物[12] ，而在羊和人的心房中，其正性变率变力作用不明显。在松弛素基因敲除小鼠，我们未能观察到显著的心功能变化[8]。
4.2 血流动力学调节作用。
在许多动物体内，循环中的松弛素在妊娠后期有所增加[1]。一般认为在此期间，松弛素通过其对肾脏、脉管系统和中枢神经系统的作用代偿性地对循环系统和血容量进行调节。体外研究显示松弛素可以扩张生殖系统以及非生殖系统如肾脏、心脏、肝脏和消化道等器官的大、小动脉[12]。长期给予啮齿类动物松弛素可以引起肾小动脉的扩张，从而明显降低肾血管阻力同时显著增加肾小球滤过率和肾血浆流量[2]。松弛素也可减轻血管对内皮素1(endothelin1, ET1)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)和儿茶酚胺的收缩反应[12]。在健康男性体内，容量超负荷或倾斜试验引起的血流动力学稳态失衡可显著增加肾脏松弛素的分泌，提示松弛素参与维持循环稳态。松弛素可以通过激活NOS诱导血管扩张[2,13]。在培养的血管平滑肌细胞，松弛素浓度依赖性地增加NOSⅡ的表达和活性从而升高环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)并松弛血管平滑肌细胞。松弛素可以扩张灌注大鼠或豚鼠的冠状动脉[14]，这一作用可被NOS抑制剂所阻断。一些研究表明松弛素的作用与其上调和活化血管内皮细胞或血管平滑肌细胞上的ETB受体有关[2]。松弛素不能引起ETB受体缺陷鼠的肾小动脉扩张，提示ETB受体对松弛素功能的正常发挥是不可或缺的。有趣的是，松弛素的扩血管作用可以被基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)抑制剂阻断。因此在血管内皮细胞上，松弛素可上调MMP的活性而后由MMP将ET1剪切为ET132，后者进一步激活ETB，并提高NOS的活性。也有证据显示长时间应用松弛素可以改变动脉的机械特性，包括动脉顺应性的增加、心输出量的增加以及外周血管阻力的降低[15]。在大鼠高血压性疾病模型中，如缺氧诱导的肺动脉高压[16]，松弛素治疗可以明显降低肺血管阻抗，同时右室压力降低；较高剂量时还可减少肺动脉壁内的胶原含量[16]。在SHR可以观察到松弛素的扩血管作用和降血压作用[17]。应用松弛素对SHR的肠系膜动脉进行预处理可明显减轻其对精氨酸加压素或去甲肾上腺素的缩血管反应[18]。除了直接的扩血管和血管重塑作用外，松弛素也可通过中枢机制调节水的摄入以及通过对肾功能的影响而调节血容量。这些作用对妊娠后期内环境稳态的维持尤其重要[12]。给大鼠脑室内注射松弛素可以促进大鼠水的摄入量。此作用可被AngⅡⅠ型受体(AT1)拮抗剂Losartan阻断，进而提示松弛素可以激活中枢AngⅡ/AT1系统。综上，松弛素主要通过以下机制调节循环稳态：首先，通过加强NO依赖的舒张效应降低血管张力从而拮抗几种缩血管物质的作用；其次，通过其中枢效应影响机体的摄水以及其对肾功能的调节作用维持血容量平衡；第三，参与脉管系统的重塑，后一作用在高血压等疾病中尤其重要。
4.3 调节心肌肥大。
有研究表明，松弛素可刺激心脏心房肽的合成和释放。而相当多的证据表明，心房肽的增加具有抑制心肌肥大的作用。在灌注的大鼠心脏中，机械负荷的增加与松弛素的上调有关[2]。也有证据显示松弛素可以抑制心肌成纤维细胞的活化、增殖和功能。有趣的是，体外研究已证实活化的成纤维细胞可通过分泌一些生长因子促进细胞肥大的发展。这些因子包括AngⅡ、转移生长因子β(transforming growth factorβ, TGFβ)、白介素6(interleukin6, IL6)等。而松弛素对AngⅡ、TGFβ、IL6等肥大相关调控因子具有拮抗作用[7]。我们最近用松弛素治疗9—10月龄的SHR大鼠，发现松弛素对实验动物的左室重量、心肌细胞大小和ANP等肥大相关基因的表达均没有影响[12]；松弛素的mRNA和蛋白表达在SHR心脏明显升高[10]；心脏肥大指数与松弛素的蛋白表达间存在显著负相关关系。我们新近的研究证实，松弛素1敲除雌鼠在摘除性腺后于9月龄时发生心肌肥大[19]。考虑到心肌间质成纤维细胞可以促进心肌细胞的肥大，我们用培养的乳鼠心肌细胞研究了松弛素对心肌肥大的作用。结果发现，松弛素对α肾上腺素能受体阻断剂苯福林诱发的心肌肥大没有影响，然而成纤维细胞条件培养液诱导的心肌细胞肥大则可被松弛素明显抑制[35]。在这项实验中，松弛素还可抑制成纤维细胞α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin, αSMA)的表达和AKt的磷酸化。
松弛素具有对缺血性和过敏性心肌损伤的保护作用。应用在体缺血/再灌注模型已证实，若急性给予松弛素可明显减轻大鼠或猪心肌特征性酶或蛋白质的漏出、过氧化产物的积聚、细胞内钙超载以及形态学异常等心肌损伤[2021]。在松弛素存在的情况下，缺血心肌还表现出循环炎症细胞的浸润和积聚减少[2021]。在大鼠缺血/再灌注过程中，松弛素还可减轻心律失常的严重程度，提高存活率[20]。松弛素也可以减少猪的心肌梗死面积和凋亡细胞数[21]。而松弛素的抗凋亡作用早已在生殖组织中观察到[1]。在应用异丙基肾上腺素诱导心肌损伤的模型中，松弛素治疗10d可减少心肌细胞内酶的释放、降低血浆ET水平、减少心脏丙二醛含量以及减轻局部炎细胞的浸润和纤维化[9]。这些实验结果均说明了松弛素具有良好的心功能保护作用。与松弛素的心功保护作用相关的机制可能包括：保护冠状动脉的完整性、抗氧化功能、防止炎性中性粒细胞的积聚以及随后前炎症性细胞因子的释放、抑制血小板的积聚、中性粒细胞的活化及与血管内皮细胞的黏附[2223]。此外松弛素还可激活NOS，并增加冠状血管NO的生成[12]。灌注液中加入的松弛素可以减轻离体灌注豚鼠心脏的缺血/再灌注损伤，说明松弛素具有直接的心肌保护作用。松弛素也可稳定肥大细胞[24] ，减少诸如组胺、白三烯、前列腺素、细胞因子、趋化因子以及蛋白酶的释放。有证据表明这些肥大细胞来源的因子在心肌或骨骼肌的缺血/再灌注损伤中有一定作用。然而对松弛素心肌保护作用的分子机制知之甚少。我们最近在培养的心肌细胞上发现H2O2介导的氧化应激引发的细胞凋亡可以被松弛素显著抑制。这一保护性作用伴随有Bcl2/Bax比值和Akt(为已知具有抗凋亡作用的PI3K通路的下游分子)水平的升高。
4.5 心梗后的修复和心肌再生。
在人类心脏损伤后紧接着的就是以疤痕形成为主的修复过程。有证据显示，心肌梗死后的细胞治疗在一定程度上减少了疤痕的形成量。然而目前的研究表明往正常或梗塞心肌中植入干细胞，其成活率甚低。此外，疤痕的迅速形成使得干细胞的归巢和增殖成为不可能，并妨碍了干细胞来源的新生肌细胞与原有心肌细胞在功能上的整合。因此，疤痕形成这一心梗后的常见结果可能是防止心肌修复性生长的重要因素。故在结合细胞移植时对宿主组织的纤维化反应进行调节在细胞治疗领域具有潜在利用价值。对松弛素抗纤维化作用的确定提示：应用松弛素抑制疤痕的形成可能会对心脏病的干细胞治疗有益。最近有研究报道在共培养的骨骼肌肌原细胞和成年心肌细胞中加入松弛素可改善细胞与细胞间的融合[25]。在子宫内膜和某些类型的肿瘤组织中，松弛素可以通过诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达使月经出血量增加，或促进肿瘤的生长[1,26]。有人报道在缺血损伤部位，松弛素可以通过上调VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的表达以及对损伤修复的促进作用刺激血管的生成[27]。最近的研究表明在骨骼肌撕裂性损伤后，局部给与松弛素可以抑制纤维化并促进肌原细胞再生[28] 。目前需要研究的是松弛素的促修复作用是否会因损伤的种类不同(如缺血性和非缺血性损伤)而异。松弛素也可以增加胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor1, IGF1)的表达和信号，而已知IGF1能够促进肌肉的再生[29]。
关于松弛素生理功能报道最多的是其对胶原降解的促进作用。在心脏和血管的病理重构过程中，一些生长因子、细胞因子和内源性调节因子可以促进纤维化，且纤维化与动脉的硬化及室壁僵硬度的增加有关，这将最终导致心肌和血管结构改变及功能异常。越来越多的证据表明松弛素可以防止或逆转心脏纤维化的形成[7,12]。在心脏[8]和其他器官[3031]的发育及衰老过程中，松弛素是一种重要的内源性胶原代谢调节因子。我们发现，雄性松弛素敲除小鼠会逐渐出现年龄相关性心脏纤维化。这种纤维化以心室Ⅰ型胶原mRNA表达(6月龄起)、胶原含量及胶原浓度(9月龄起)的增加为特点[8]，并引起心房肥大、左室舒张功能异常等表型变化[8]。有趣的是，这些心脏表型方面的变化在年龄高达2年的雌性松弛素敲除小鼠身上却未观察到。目前关于转基因小鼠模型心脏表型的性别差异已有较多报道[32]。我们目前正在研究该性别差异的激素和分子机制。RXFP1受体敲除小鼠在胶原调节的许多方面与松弛素敲除小鼠相似。RXFP1受体敲除小鼠[33]和松弛素敲除小鼠[34]均表现出乳头和乳腺的发育障碍，此外还表现出程度较低的妊娠障碍。这些表现与乳头及雌性生殖器官中的胶原含量增加有关。这两种基因敲除小鼠还可表现出与年龄相关的肺、肾纤维化[34]。这些发现提示松弛素的多种抗纤维化及胶原相关作用是通过RXFP1受体介导的。
我们发现，H2松弛素对于非激活状态下新生大鼠心肌成纤维细胞的功能和胶原表达没有影响[7]。然而，在应用TGFβ或AngⅡ激活成纤维细胞后，H2松弛素可以明显抑制心肌成纤维细胞的增殖、分化及间质胶原的合成和分泌。同时MMP2表达增高，其诱导的胶原降解过程加强[7]。我们已证实松弛素可降低3种(松弛素基因缺陷[7]、心脏过表达β2肾上腺素受体[7]和高血压[12])心肌病模型中的左室纤维化。最近，H3松弛素也被证实可减轻大剂量异丙基肾上腺素诱导的心肌缺血性损伤模型中的心脏纤维化[9]。我们最近的研究则证实将携带小鼠松弛素基因的腺病毒静脉注射于7月龄的β2肾上腺素受体过表达小鼠，可以使其左室胶原含量恢复至野生对照组水平。与体外研究中松弛素不影响胶原的基础表达水平相一致的是松弛素仅抑制异常增多的纤维化，而对无病变的器官没有作用[12]。这些研究证明松弛素是一种有效的、作用迅速、安全的抗纤维化因子。在松弛素被成功应用于临床以前，需要进一步明确疾病状态下RXFP1受体的调节和活化机制，以及病理条件下松弛素抗心血管系统纤维化作用的相关信号机制。