生长期和品种对灵芝萃取物三萜含量的问题和策略

灵芝Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.）P.Karst.，属于担子菌门Basidiomycota，灵芝科Ganodermataceae，灵芝属Ganoderma P. karst.它是我国最为名贵的药用真菌之一。近年来，关于灵芝的研究已得到东南亚国家以及美国、加拿大等国有关学者的广泛关注。大量现代研究表明，灵芝含多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白质、多肽、脂肪酸等多种生物活性成分。灵芝三萜是灵芝的关键药效成分，主要是一类高度氧化的羊毛甾烷衍生物，具有重要的药理作用，如抗肿瘤，抗细胞毒性，抗HIV—1型病毒，护肝，解毒等，且具有诱导NADPH、改善记忆力等功能[1—6]。近期研究表明，灵芝酸A、F、H具有阻止乳癌生长和作为治疗癌症辅助剂的作用，赤芝酸具有通过线粒体介导的途径诱导人体白细胞凋亡以及阻止癌细胞侵染的作用等[2]；灵芝Me和灵芝酸T具有抗肺癌肿瘤作用[3]。但是，由于灵芝酸类化合物结构相似，且较难得到足量对照品化合物，从而使三萜含量HPLC测定方法存在一定困难[2—8]。 　　近年来，指纹图谱技术已成为研究和控制中草药质量的一种主要方法，它能全面反映中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量[9—10]。本研究应用HPLC指纹图谱技术，研究不同品种和不同生长期对灵芝子实体三萜成分的影响，探讨灵芝品种和生长期对三萜含量和种类的影响，为灵芝生产提供可靠依据。 论文代写 1 材料和方法 　　1.1 材料与试剂 　　赤灵芝：来源于天津市天寿食用菌科技有限公司。灵芝品种：G9、G18、南韩（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）。灵芝生长期：从灵芝子实体开始分化形成时，每间隔10 d采集的灵芝子实体，标记为S1、S2、S3和S4，分别表示第一生长阶段、第二生长阶段、第三生长阶段和第四生长阶段。灵芝三萜萃取物：课题组自制，方法见1.3.2。 　　甲醇（4 L、色谱纯），冰醋酸（500 mL、分析纯）：天津东科仪器设备有限公司。 　　1.2 仪器与设备 　　Agilent1200高效液相色谱仪：真空脱气机（G1322A），四元泵（G1311A），自动进样器（1329A），柱温箱（G1316A），二极管阵列检测器（G1315D），美国Agilent公司。Agilent化学工作站。旋转蒸发器（RE52—2，上海沪西分析仪器厂有限公司）；分析天平（FA1004，上海方瑞仪器有限公司）。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 高效液相色谱（HPLC）条件 色谱柱：ZORBAX SB—C18（4.6 mm150 mm，5 um）；流动相：体积分数1%醋酸（A）—甲醇（B），梯度洗脱程序（表1）；柱温：25 ℃；进样量5 l；流量：0.8 mLmin—1；检测波长：254 nm，参比波长360 nm。 　　1.3.2 供试品溶液的制备 称取5 g灵芝样品，按有机溶剂萃取方法：干燥灵芝粉碎95%乙醇提取提取液浓缩氯仿提取提取液浓缩褐色浓缩液，即为灵芝萃取物。然后取0.25 mL萃取物，甲醇定容至5 mL。再从中取1 mL，过0.45 m滤膜待用[11—17]。 简历大全 /html/jianli/ 　　1.3.3 指纹图谱软件 中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）。 　　1.3.4 总峰面积的计算 总峰面积=大于2%总峰面积的各峰面积的总和。 　　2 结果与分析 　　2.1 灵芝不同生长期的三萜萃取物HPLC图谱比较 　　绘制不同生长期指纹图谱重叠图，选取24个共有色谱峰，如图1所示。试验结果表明，S1、S2、S3、S4各阶段萃取物的HPLC图谱相似度较高，均高于0.93。由图1可以看出，子实体从开始分化形成时到子实体成熟期间，三萜类化合物的种类基本稳定。这与邢增涛、Masao Hirotani等人的研究报道是一致的。 　　通过计算不同生长期总峰面积，表2结果显示，第二生长阶段总峰面积和最大，第一生长阶段则最小。 　　由图2可以看出，1～9号色谱峰均在第二生长阶段（S2），峰面积较大，而10～14号色谱峰在第三生长阶段（S3），峰面积也较大。这可能是因为，在灵芝成长中，由于三萜类化合物存在不断地分解与合成等代谢过程，导致不同生长期三萜量不同。 　　2.2 不同品种灵芝三萜萃取物的HPLC图谱比较 　　图3中S1～S6分别为G9、G18、南韩（NH）、京大（JD）、G4、美芝（MZ）等6个品种。图3结合表3，比较结果表明，各品种间相似度均小于0.90，其中，相似度为0.857的是京大和南韩；相似度为0.839的是G9和G18；相似度为0.817的是美芝和G18；而G4品种与其它品种的相似度均低于0.8。 毕业论文 　　表4结果显示，不同品种灵芝萃取物的HPLC总峰面积大小顺序为美芝（MZ）、G4、G9、京大（JD）、南韩（NH）、G18。 　　3 结论与讨论 　　经HPLC高效液相指纹图谱软件分析，不同生长阶段所得灵芝子实体三萜萃取物的HPLC图谱的相似度较高，均大于0.93；且子实体从开始分化形成时到子实体成熟期间，三萜类化合物的种类基本稳定，但在灵芝子实体喷孢子之时，灵芝三萜萃取物的HPLC指纹图谱的总峰面积最大。这可能是因为，在灵芝成长中三萜类化合物存在不断地分解与合成等代谢过程，导致不同生长期三萜量不同。 　　灵芝的6个品种G9、G18、南韩（NH）、京大（JD）、G4和美芝（MZ），各品种间子实体三萜萃取物的HPLC图谱的相似度均小于0.90，其中，相似度为0.857的是京大（JD）和南韩（NH）；相似度为0.839的是G9和G18；相似度为0.817的是美芝（MZ）和G18；而G4品种与其它品种的相似度均低于0.8；此外，按灵芝三萜萃取物的HPLC指纹图谱的总峰面积大小排序为：美芝（MZ）G4G9京大（JD）南韩（NH）G18。 　　参考文献： 　　[1] 陶文沂，敖宗华，许泓瑜.药食用真菌生物技术[M]. 北京：化学工业出版社（生物医药出版分社）， 2007.

开题报告 /html/lunwenzhidao/kaitibaogao/ 　　[2] 丁平，梁英娇，罗进辉，等.灵芝中6种主要三萜酸类成分的HPLC定量分析[J].中国药学杂志，2009，44（11）：822. 　　[3] 刘建文.灵芝酸Me和灵芝酸T的抗肿瘤活性研究[C]// 第二届中国药理学会补益药药理专业委员会学术研讨会论文汇编.承德：中国药理学会补益药药理专业委员会，2012：16—17.　　[4] 赵佳，陈晓辉，毕开顺. HPLC同时测定赤芝中4种三萜酸的含量[J]. 中国中药杂志，2009，34（17）：2220. 　　[5] 王筱婧，林焕冰，徐江，等. HPLC法和UV—vis法测定灵芝孢子粉中灵芝三萜及灵芝多糖的含量[J]. 当代医学，2009，15（31）：128. 　　[6] 冯娜，张劲松，唐庆九，等. 灵芝三萜的HPLC检测方法的研究[C]//第九届全国食用菌学术研讨会摘要集.上海：

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