辐射对体外培养MC3T3—E1成骨前体细胞增殖和分化的效果研究
高剂量的放射治疗会对正常的骨组织产生不良作用，如骨质疏松、放射性骨坏死、颅面部骨生长迟缓等。
1983年，Marx[1]提出了被广泛接受的骨坏死病理机制：即射线引起动脉内膜炎，接着发生组织缺氧、细胞数减少以及血管减少，最终出现慢性不愈合的伤口。
其后学者们的研究更加关注于骨细胞，并认为骨细胞的改变要先于血管，而骨重建的抑制是发生骨坏死的关键所在[2]。
本文拟从MC3T3— E1成骨前体细胞入手，探讨60Co 射线对成骨细胞增殖和分化的影响，为辐射骨损伤的防治提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 主要试剂与仪器设备 —MEM培养基（HyClone公司，美国），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），—磷酸甘油、抗坏血酸（西安沃尔森生物技术有限公司），3—（4，5—二甲基—2—噻唑）—2，5—二苯基溴化四氮唑噻蓝 [3—（4，5—dimethylthiazol—2—yl）—2，5—diphenylte—tra—zolium bromide，MTT]（西安科昊生物工程有限责任公司）；黏胶纤维红（Sigma公司，美国），茜素红（西安舟鼎国生物技术有限公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）相关试剂（TaKaRa公司，日本）；酶标仪（BIO—TEK公司，美国）；60Co源（第四军医大学钴源室）；7500型qPCR仪（ABI公司，美国），基因扩增仪（东胜创新生物科技有限公司）。
1.2 细胞培养及成骨诱导 采用MC3T3—E1成骨前体细胞系亚克隆14（上海中科院细胞库）进行实验。
使用含10%新生牛血清、100 IUmL—1青霉素和100 ?gmL—1链霉素的—MEM培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，常规换液与传代。
成骨诱导培养基：在上述培养基里添加5 mmolL—1的—磷酸甘油和50 ?gmL—1抗坏血酸。
1.3 细胞辐射 MC3T3—E1细胞接种24 h后进行60Co 射线照射。
1.4 细胞增殖实验 细胞以每孔1.5103个的密度接种于96孔板，培养24 h后分别接受4、8 Gy射线照射。
照射后1、3、5、7 d终止培养，PBS漂洗1次，每孔加入20 L MTT（5 gL—1）和200 L无血清—MEM培养基。
37 ℃孵育4 h后吸弃上清，每孔加入150 L二甲基亚砜溶解生成的结晶物，室温下振荡20 min，然后置于分光光度仪上于490 nm处测量其光密度（optical density，OD）值。
1.5 细胞胶原分泌的测定 使用黏胶纤维红染色法测定胶原分泌[3]。
细胞以每孔7.5104个的密度接种于6孔板，培养24 h后接受4、8 Gy射线照射。
辐射后第12天终止细胞培养，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍。
0.1%黏胶纤维红（溶于饱和苦味酸）染色18 h，盐酸漂洗，细胞照相。
定量分析时，加入氢氧化钠溶解染色，570 nm处测量OD值。
1.6 成骨相关基因mRNA表达的测定 采用qPCR法检测4种成骨相关基因mRNA的表达，分别为Runt相关转录因子2（Runt—related transcrip—tion factor 2，RUNX2）、转录因子Osterix（OSX）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和骨钙素（osteocal—cin，OCN）。
细胞以每孔7.5104个的密度接种于6孔培养板，培养24 h后分别接受4、8 Gy射线照射。
辐射后第16天终止细胞培养，PBS漂洗后用适量Trizol裂解细胞，按试剂盒描述的步骤提取总RNA并定量。
取 1.0 g总RNA，按照Prime Script RT reagent Kit说明进行逆转录，条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。
配制qPCR反应液，所使用的引物见表1，使用甘油醛— 3—磷酸脱氢酶（glyceraldehyde—3—phosphate dehydroge—nase，GAPDH）作为内参，置于7500型qPCR仪内进行反应。
采用2—Ct法对数据进行相对定量分析，0 Gy组数据作为校正样本。
1.7 细胞基质矿化测定 使用茜素红染色测定细胞基质矿化情况。
细胞以每孔5104个的密度接种于6孔板，培养24 h后接受4、8 Gy射线照射。
辐射后第28天终止细胞培养，PBS漂洗2次，75%乙醇固定1 h。
40 mmolL—1茜素红染液（pH=4.2）室温染色20 min，PBS漂洗5次后10%氯化十六烷基吡啶溶解染色，置于分光光度仪上于570 nm处测OD值。
1.8 统计学分析 使用SPSS 16.0统计分析软件，采用单因素方差分析（one—way ANOVA）比较各组均数之间有无差异，Tukey显著差异法进行均数之间的两两比较，检验水准为双侧=0.05。
与未辐射组相比，从辐射后第3天开始，4、8 Gy的辐射剂量均导致MC3T3—E1细胞的增殖明显降低（P0.05），并且这种降低呈现剂量依赖性。
2.2 细胞胶原分泌 经不同剂量的辐射后，MC3T3—E1细胞胶原分泌的染色情况见图1：随辐射剂量的增加，染色强度逐渐降低。
对照组（0 Gy）、4 Gy和8 Gy组胶原定量分析的OD值分别为1.3680.208、1.0590.169和0.8560.078，3组间的差异有统计学意义（F=7.738，P=0.022），8 Gy组明显低于对照组。
2.3 成骨相关基因mRNA的表达 4种成骨相关基因的表达见表3：4 Gy以上射线可以明显抑制MC3T3—E1细胞OSX和OCN基因的表达（P0.05），但对RUNX2基因无明显影响（P 0.05）；8 Gy射线可轻微下调细胞OPN基因的表达，但与对照组相比差异并无统计学意义（P0.05）。
[毕业论文网专业提供代写论文的服务 欢迎光临] 2.4 细胞基质矿化 对照组（0 Gy）、4 Gy和8 Gy组细胞基质矿化定量分析的OD值分别为2.1550.257、1.7280.265、1.4850.042，3组差异有统计学意义（F=7.497，P= 0.023），随着射线剂量增大细胞基质矿化降低，8 Gy照射组与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）。
3 讨论 MC3T3—E1成骨前体细胞系来源于新生小鼠颅顶骨，在体外可以分化为骨细胞，是较常用的研究射线对成骨细胞影响的细胞系之一[4]。