体外诱导神经干细胞移植治疗失神经肌萎缩的实验研究
作者：黄新 江长青 肖颖锋 万圣祥。
【摘要】 目的：观察维甲酸（RA）体外诱导神经干细胞后体内移植治疗失神经肌萎缩的效果。方法：共使用成年SD 大鼠28 只，切断两侧坐骨神经，随机选择一侧直接吻合坐骨神经作为对照组，实验组从孕龄15 d 的胚胎SD 大鼠脊髓组织中分离获得脊髓源性神经干细胞，经维甲酸（RA）体外诱导后，显微注射到SD 大鼠失神经支配的一侧踇长伸肌中，术后16 周神经电生理和免疫组织化学等方法观察。结果：实验组与对照组间的踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，神经肌纤维传导速度的数目无统计学差异（P ＞ 0.05）。结论：神经干细胞经体外诱导后体内移植具有治疗失神经肌萎缩的作用。
observe the effect of induction of neural stem cells in vitro and then to preventdenervation muscular atrophy in vivo. Methods The spinal cord—derived neural stem cells of SD fetal rats afterpregnant 15 days were harvested and cultivated in serum–free medium, differentiated and induced by RA in vitro,Thenneural stem cells were random microinjected into single extensor hallucis longus of 28 SD rats which were transectedsciatic nerve ,others choosen as control groups which were repaired sciatic nerves, the two groups were examined bymuscular electrophysiological examination and cellular immunohistochemistry 16 weeks postoperatively. ResultsThe differents of the mean peak of CMAP(extent of muscle fibrillation waves) , the mean NCV（velocity of musclefiber nerve conduction）in experiment group and normal control group was not statistically significant (P 0.05).Conclusions Neural stem cells by diferentiated into cholinergic neurons induced with RA in vitro can therapydenervation muscular atrophy in vivo.
〔Key Words〕 Stem cells; Retinoic acid; Cholinergic neuron。
失神经支配后，骨骼肌立即停止收缩，肌组织失去神经元原来的营养因子，发生萎缩、纤维化、往往再生的神经轴突尚未到达靶肌肉，运终板已经发生碎裂和崩解，导致功能无法恢复，这是外周神经损伤后治疗极为棘手的问题。神经干细胞是一群具有多向分化潜能的原始细胞，在特定的因素影响或诱导下，能向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化[1，2]。将其作为细胞移植材料对中枢神经系统疾病和外伤引起的神经元缺失具有良好效果，而且已有临床应用报道。在2006 年8 月－2008 年2 月间，我们利用在体外培养诱导的胎鼠脊髓的神经干细胞移植到SD 大鼠切断神经支配的踇长伸肌的上1/3 部，观察其在治疗失神经肌萎缩中的作用。
1 材料与方法。
1.1 材料。
DMEM/F10（Gibco），B27(Sigma)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，RD），维甲酸（Gibco），神经元无血清限定性培养基（Gibco），胎牛血清( 四季青)， 磷酸盐缓冲溶液（phosphate bufferedsolution，PBS）（Sigma）， 兔抗大鼠神经上皮干细胞蛋白(nestin) 抗体、兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶（CHAT）抗体、兔抗大鼠神经胶质酸性蛋白（GFAP）抗体、兔抗大鼠微管相关蛋白–2（MAP2）抗体；FITC 标记的羊抗兔二抗和Cy3 标记的羊抗兔二抗，荧光显微镜。
1.2 胎鼠神经干细胞的体外培养与诱导参照Reynolds 等[3] 的方法，孕15 d 的重约250g SD 大鼠颈椎脱臼致死，酒精浸泡消毒后移入无菌操作箱，取出胎鼠去头，用显微器械取出脊髓组织，于10 倍手术显微镜下去除脊髓外膜，在预冷的D–Hank’S 液中用吸管缓慢吹打数次，使其分离成单细胞，将细胞悬液移至离心管中，1 500 r/min 离心5 min 弃去上清液，用限定性培养液（内含DMEM/F10、2 ％ B27，20 ng/mL bFGF） 重悬细胞沉淀，37℃、5％ CO2 条件下悬浮培养，视细胞生长情况每隔3~5 d 换液1 次。3 周后吸取部分神经干细胞的免疫荧光鉴定，检测抗原为Nestin，神经干细胞纯度达到90％。在上述神经干细胞的培养液中加入维甲酸（RA,5 μmol/L）后置于37℃、5％ CO2 培养箱中培养，分别于3 周后取培养细胞应用兔抗大鼠MAP2一抗（1:200），Cy3 标志的羊抗兔二抗（1:50），兔抗大鼠GFAP 一抗（1:200），FITC 标记的羊抗兔二抗（1:50）来检测神经干细胞的分化，再次以小鼠抗胆碱乙酰转移酶(CHAT) 抗体双重标记。免疫荧光鉴定，荧光显微镜下观察拍照。
1.3.1 动物模型制作 200~250 g 成年健康SD大鼠28 只（中山大学实验动物中心提供），质量百分比为1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后消毒铺单。于双侧大腿后外侧行直切口，显露坐骨神经，于中段处切断，实验分两组：随机选择一侧直接吻合修复坐骨神经（对照组），另外一侧显微种植体外培养的神经干细胞悬液于踇长伸肌上1/3 部（实验组），术后饲养16 周。
1.3.2 细胞移植、取材与免疫组化鉴定 将已经培养的神经干细胞与DMEM 培养液混合后制成浓度为105 mL 悬液，在10 倍手术显微镜下应用100。
μm 玻璃筒不锈钢针头显微注射器显微注入干细胞悬液于随机选择的大鼠一侧踇长伸肌上1/3 部肌肉组织中，术后单笼饲养16 周。16 周后分别测双踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，坐骨神经肌纤维神经传导速率后，再次以1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分别以4％ 多聚甲醛和生理盐水经左心室插管灌注，原切口进入后游离切取踇长伸肌，称湿重后，10 μm 片厚冰冻切片并贴片，小鼠抗胆碱乙酰转移酶（CHAT）抗体免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察拍照，检测胆碱酯酶运动神经元。
1.4 观察指标。
1.4.1 神经干细胞体外诱导成胆碱酯酶运动神经元的情况 维甲酸体外诱导神经干细胞后，以MAP2，GFAP 鉴定诱导分化成神经元的比例，再加。
入小鼠抗胆碱乙酰转移酶（CHAT）抗体双重标记显示诱导成胆碱酯酶运动神经元比例。
1.4.2 神经电生理检测 术后16 周，在麻醉下无菌手术显露移植物全长，用Keypoint 3.02 型便携式四导程神经电生理仪于近端吻合口近侧刺激坐骨神经，在踇长伸肌记录坐骨神经肌纤维神经传导速率及踇长伸肌肌肉纤颤电波幅度，应用SPSS 13.0软件进行t 检验。
1.4.3 组织学检查 切取踇长伸肌，称湿重后，10% 福尔马林固定的标本常规石腊包埋，行CHAT免疫细胞荧光染色，观察胆碱酯酶运动神经元数量。