老年人胃癌肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态
作者：蔡建春， 刘棣， 张海萍， 钟山， 夏宁邵。
【摘要】 目的分析老年人胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法，检测51例老年人胃癌及其癌旁小凹上皮和15例慢性胃炎小凹上皮石蜡标本中E钙黏素（ECD）、错配修复酶hMLH1、APC和6氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态。结果在胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中，基因总的甲基化率分别为70.6%（36/51例）、47.0% (24/51例) 和6.6％（1/15例），三者之间差别有统计学意义（P＜0.01）。Lauren弥漫型、Ming浸润型、低分化和未分化、Ⅲ期和Ⅳ期、T3和T4以及有淋巴结转移胃癌的甲基化率分别高于Lauren肠型、Ming膨胀型、高和中分化、Ⅰ期和Ⅱ期、T1和T2以及无淋巴结转移胃癌的甲基化率（均P＜0.05）。结论ECD、hMLH1、APC和MGMT基因启动子区甲基化在慢性胃炎小凹上皮中少见，在癌旁小凹上皮中频繁出现，在胃癌组织中普遍存在，提示甲基化可能是胃癌发生的早期事件。
【关键词】 遗传学研究； 甲基化； 胃肿瘤； 基因，肿瘤抑制癌基因。
真核生物基因启动子区甲基化参与基因的表达调控、调节胚胎发育、基因组印迹和X染色体灭活，甲基化异常与衰老、肿瘤密切相关，对一些肿瘤相关基因的研究证实了这一点[1]。胃癌是老年人的常见病、多发病，且随着年龄的增长发病率上升。笔者探讨老年人上述组织E钙黏素（ECD）、错配修复酶hMLH1、APC和6氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态。
1材料与方法。
1.1材料。
1.1.1标本选自2002年12月～2006年2月手术切除胃癌石蜡标本51例，胃镜活检慢性胃炎小凹上皮石蜡标本15例，行常规组织切片,HE染色和病理诊断。51例中, 男性42例，女性9例，年龄（68.8±2.65）岁（60～83岁）。临床病理分期（按国际抗癌联盟1997年pTNM分期标准）[2]：Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期40例；病理分级：高、中分化腺癌20例，低分化腺癌27例，未分化癌和印戒细胞癌4例；Lauren肠型20例，弥漫型31例；Ming膨胀型24例，浸润型27例。实验方案经患者知情同意签署和院伦理委员会批准。
1.1.2主要试剂CpGenome DNA修饰试剂盒(美国加拿大Chemicon公司)；Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)；引物由上海英俊生物技术公司合成；B淋巴瘤细胞株Raji和人宫颈癌细胞株Hela引自美国模式菌种收集中心（ATCC）。
1.2方法。
1.2.1DNA提取按胃癌组织、癌旁5 cm小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮分成3组。在显微镜下进行观察、标记，采用文献[3]方法取出上述组织，分别放入1.5 mL离心管，加入裂解缓冲液200 μL(10 mmol/L TrisHCl, pH 8.0, 100 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl26H2O, 0.45% Tween20）和蛋白酶K溶液30 μL（20 mg/mL），在56 ℃条件消化12～16 h，4 ℃离心（12 000 r/min），吸出上清液，移至新的离心管，—20 ℃保存。
1.2.2DNA亚硫酸氢盐修饰取已抽提的DNA(10 ng/μL) 1.0 μg，按照CpGenome DNA修饰试剂盒的操作步骤进行。
1.2.3MSP反应采用套式PCR，总反应体系：DNA 2.0 μL,正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP 0.2 μL，10×缓冲液2 μL，加三蒸水至20 μL。每次反应都采用Raji细胞株作为阳性对照，Hela细胞株作为阴性对照。PCR反应条件：预变性5 min，95 ℃ 30 s→30 s→72 ℃ 30 s，35循环，72 ℃再延伸10 min(表1)。
1.2.4产物鉴定及结果判定配制3%琼脂糖凝胶，PCR产物用溴酚蓝染色，取产物5～10 μL，加样于琼脂糖凝胶加样孔，置于电泳槽中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压180 V。当溴酚蓝条带迁移至琼脂糖凝胶2/3处时终止电泳，紫光灯下观察电表1肿瘤抑制基因启动子区甲基化和非甲基化PCR引物泳条带，凝胶成像仪采集图像。ECD、hMLH1、APC和MGMT基因启动子区甲基化和非甲基化电泳条带大小(bp)分别为167和178，124和118，97和108，81和93。若甲基化引物扩增出现条带，说明该病例发生甲基化，若非甲基化引物扩增出现条带，说明该病例处于非甲基化状态。
1.3统计学处理数据处理采用SPSS 12.0软件包。采用Fisher精确检验，P＜0.05为差别有统计学意义。