VEGF, b
VEGF and bFGF induced differentiation of mononuclear cells from human umbilical cord blood into endothelial progenitor cells in vitro。
【Abstract】 AIM: To research a way for mononuclear cells from human umbilical cord blood in vitro to be differentiated into endothelial progenitor cells under the induction of VEGF and bFGF. METHODS: The mononuclear cells were obtained from human umbilical cord blood by Ficoll densitygradient centrifugation. The cells were suspended in medium 199(M199) supplemented with VEGF, bFGF for culture, differentiation, proliferation and identification. The expressions of specific antigens on cell surface were analyzed by immunohistochemistry and immunofluorescence. RESULTS: The mononuclear cells from human peripheral blood which were cultured and induced in vitro by VEGF and bFGF were positive for KDR, CD1133 and CD34. CONCLUSION: Mononuclear cells from human umbilical cord blood can be induced to differentiate into endothelial progenitor cells in vitro under certain condition.
【Keywords】 fetal blood; endothelial progenitor cells; induction。
【摘要】 目的： 研究VEGF, bFGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化. 方法： 从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在加有VEGF，bFGF的M199培养基中培养，培养7 d，免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果： 人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, bFGF的诱导分化，表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34. 结论： 人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞. 【关键词】 胎血；内皮祖细胞；诱导。
0引言 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞［1］. 研究发现, EPC不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,因此, EPCs在冠心病、肿瘤、创伤愈合等疾病具有广阔的临床应用前景. 今年来，EPCs在基础研究、心血管疾病、肢体缺血性疾病等领域的研究十分活跃，国外关于EPCs的研究初步深入，而在国内EPCs的研究尚处于起步阶段. 我们从人脐血中分离培养、体外扩增并观察EPCs的体外分化过程，为EPCs的进一步研究打下基础.
1材料和方法。
1.1材料比重1.077±0.001的聚蔗糖泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）. DHanks液（无Ca2+, Mg2+）. VEGF, bFGF为Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 鼠抗人CD34单克隆抗体，兔抗人KDR单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠、羊抗兔二抗，鼠抗人CD133单克隆抗体(Santa Cruz公司). M199培养液，免疫组化染色试剂盒（即用型SABC）（武汉博士德生物工程公司）. 美国Santa Cruz Bio公司荧光显微镜；OlympusCK40型倒置显微镜；低温高速离心机Biofuge22R型. 1.2方法 1.2.1EPCs的采集和分离人脐带血均取自足月健康的产妇，每份采血约40~60 mL，复方枸橼酸钠注射液（ACDA）按1∶10加入抗凝. 然后1∶1加入PBS稀释，EPCs的分离采用Ficoll密度梯度离心法. 2000 r/min, 20 min离心后管内分为三层，取上、中层界面处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带置入另一离心管中，以Hanks液离心洗涤细胞两次. 末次离心后，弃上清，以Ｍ199培养液（含有100 mL/L胎牛血清，细胞生长因子VEGF和bFGF）重悬细胞. 取一滴细胞悬液与一滴2 g/L台酚兰染色液混合，计算单个核细胞的浓度及细胞活力的检测. 1.2.2EPCs的培养单个核细胞以5×108/L的密度接种于铺有10 g/L明胶的培养瓶中，放入37℃, 50 mL/L CO2，湿度100%的细胞培养箱培养，48 h后弃去贴壁细胞，悬浮细胞离心后用M199培养液重悬，以2×108/L 的密度接种于放有盖玻片的六孔板中. 每3 d换液，用Hanks液洗掉未贴附的细胞. 在培养的第7日收集爬片细胞,进行鉴定.