川芎嗪抗实验性肝纤维化组织中TGF—β1阳性面积率表达的比较
作者：吴建红 陕 光 张端莲 叶庆斌 郑承庆 熊烈。
【关键词】 川芎嗪。
摘 要: 目的: 观察川芎嗪对大鼠实验性肝纤维化作用的治疗效果。方法: 采用四氯化碳（CCL 4 ）诱导大鼠肝纤维化模型，将 实验动物随机分为正常对照组（N）5只、肝纤维化模型组（H）20只、川芎嗪治疗组（TMP）20只，除正常对照组以外其它两组均给予 40% 四氯化碳（CCL 4 ）花生油溶液0.3ml/100g腹腔注射，每周2次，共6周。川芎嗪组于肝纤维化模型建立后给予盐酸川芎嗪 （TMP）60mg/ kg 经口灌胃，1次/d，连续治疗60天;其余两组同时给予同等剂量的生理盐水。于60天后分别处死各组大鼠。用免疫 组织化学方法染色观察肝组织中转化生长因子β1（TGF—β1）表达的变化，并利用计算机图像分析技术测量正常对照组、肝纤维化模 型组及川芎嗪治疗组TGF—β1表达的平均阳性面积。结果:免疫组织化学S—P法染色显示TMP能明显抑制肝组织中TGF—β1水平的 表达， TGF—β1在川芎嗪治疗组中的表达明显低于肝纤维化模型组， TGF—β1在川芎嗪治疗组与肝纤维化模型组之间有显著性差异（ P 0.01）; TGF—β1在川芎嗪治疗组与正常对照组中呈高表达， TGF—β1在川芎嗪治疗组与正常对照组之间差异无显著性（ P 0.05）。 结论: 川芎嗪对四氯化碳（CCL 4 ）诱导的大鼠实验性肝纤维化有明显的保护和治疗作用。
关键词: 川芎嗪; 肝纤维化; 转化生长因子β1（TGF—β1）; 免疫组织化学; 阳性面积。
肝脏由肝的实质细胞和非实质细胞构成， 实质细胞系指 肝细胞（HC） ， 而非实质细胞包括窦内皮细胞（SEC）、枯否氏 细胞（KC）、肝星状细胞（HSC） 和陷窝细胞（pit cell） ， 这些细 胞经研究表明均以不同方式参与肝纤维化（LF）的形成。 肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必由之路，部 分甚至发展为肝癌，目前仍然缺乏有效的抗纤维化的治疗。 寻找有效的抗肝纤维化的药物是目前临床研究的一个热点。 川芎嗪是中药川芎的有效成分，对肝细胞具有保护作用，具有 一定的阻抑肝纤维化作用。本研究用免疫组织化学方法染色 观察肝组织中转化生长因子β1（TGF—β1）表达的变化，并利用 计算机图像分析技术测量正常对照组、肝纤维化模型组及川 芎嗪治疗组TGF—β1表达的平均阳性面积，观察川芎嗪对大鼠 实验性肝纤维化作用的治疗效果，并探讨其作用机制。
1 材料与方法。
1.1 材料。
1.1.1 试验动物 Wister雄性大鼠（SPF级）45只，体重280 ～360g， 由武汉大学医学院动物试验中心提供。食用标准大 鼠饲料， 饮自来水， 室温22℃。
1.1.2 大鼠肝纤维化模型制备及药物应用 将40只大鼠随 机分成2组，川芎嗪组20只，对照组20只。另设正常对照组 5只。除正常组以外其它两组均给予40%四氯化碳（CCL 4 ） 花生油溶液0.3ml/100g腹腔注射，每周2次，共6周。川芎嗪 组于肝纤维化模型建立后给予盐酸川芎嗪（TMP）60mg/ kg 经 口灌胃，1次/d，连续治疗60天;其余两组同时给予同等剂量 的生理盐水。于60天后分别处死各组大鼠，取其新鲜肝脏方 叶小块组织，10% 中性甲醛中固定，常规HE染色观察肝脏组 织学改变。
1.2 试剂与仪器。
1.2.1 主要试剂 ① 浓缩型鼠抗人TGF—β1多克隆抗体（北 京中山生物技术有限公司）;② 超敏即用型S—P通用型免疫组 织化学试剂盒（福州迈新公司）;③ DAB显色试盒及多聚赖氨 酸（北京中山生物技术有限公司）。 1.2.2 主要仪器 ① YWY781B医用微波仪为浙江临安电子 器材厂生产;② 电热恒温干燥箱为湖北省黄石市医疗器械厂 生产;③ 低温冰箱为广州容声冰箱厂生产;④ 显微镜成像系 统为日本奥林巴斯公司产品。
1.3 实验方法。
免疫组织化学染色S—P法检测TGF—β1，具体步骤如下: ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧 化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗 4×5min;③ TGF—β1采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS 洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性 反应;⑤ 一抗（TGF—β1，1:40 ）37℃孵育1 h，PBS洗4×5min; ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶复合物37℃孵育10 min， PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应; ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。 用PBS代替一抗作为阴性对照组。
TGF—β1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照 组除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS—2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统 （同济千屏影像公司）对TGF—β1表达进行定量分析，每张切片 随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个 视野下阳性反应的阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳 性面积率。以每例5个视野的阳性面积率的平均值作为该例 的测量值。 阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积 中细胞的总面积×100%。