甲氧西林耐药溶血葡萄球菌大环内酯类和林可酰胺类耐药基因型与表

作者：吴伟元 潘小梅 卢月梅 吴劲松 程锦娥 甘志彪 李红林 陆坚。

【摘要】 目的 研究甲氧西林耐药溶血葡萄球菌(MRSH)大环内酯类和林可酰胺类的耐药机制。方法 琼脂稀释法测定3种抗菌药对63株溶血葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)，PCR技术检测mecA、ermA、ermB、ermC、msrA/msrB和linA/linA′耐药基因。结果 62株MRSH均携带mecA，最常见大环内酯类和林可酰胺类耐药基因为msrA/msrB(59.7%)，其次linA/linA′(50%)和ermC(32.3%)，50%菌株携带2种耐药基因，3.2%菌株携带3种耐药基因；21株携带erm均对红霉素高耐(MIC≥256μg/ml)，对克林霉素结构型MLSB或诱导型MLSB耐药；14株携带msrA/msrB对红霉素中度耐药(MIC=32或64μg/ml)；31株携带linA/linA′，3株对克林霉素耐药，其余均对克林霉素敏感。结论 MRSH携带msrA/msrB、linA/linA′和ermC基因是其对大环内酯类和林可酰胺类产生耐药的主要原因。

【关键词】 溶血葡萄球菌； 大环内酯类； 林可酰胺类； 耐药基因。

ABSTRACT Objective To investigate the prevalence of resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillinresistant S.haemolyticus (MRSH). Methods Agar dilution method was performed to detect the minimal inhibition concentration (MIC) of 3 antimicrobial agents against 63 strains of S.haemolyticus, and the resistance genes of mecA, ermA, ermB, ermC, msrA/msrB and linA/linA′ were anzlyzed by PCR in all clinical isolates. Result Among the 62 isolates of MRSH estimated by harboring the mecA gene, high occurrence of macrolides and lincosamides resistance genes msrA/msrB (59.7%), linA/linA′ (50%), and ermC (32.3%) were found; 50% of MRSH were detected harboring two different resistance genes, and 3.2% were detected harboring three; 21 strains with erm gene demonstrated high resistance to erythromycin (MIC≥256 μg/ml), and constitutive MLSB or inducible MLSB resistance to clindamycin; 14 isolates with msrA/msrB gene showed moderate resistance to erythromycin (MIC=32 or 64 μg/ml); 31 strains with linA/linA′ gene were all susceptible to clindamycin, with the except of three ones. Conclusion Resistance to macrolides and lincosamides in MRSH was mainly due to the presence of msrA/msrB, linA/linA′ and ermC genes.

KEY WORDS Staphylococcus haemolyticus; Macrolides; Lincosamides; Resistance gene。

大环内酯类和林可酰胺类是临床上治疗葡萄球菌感染常用的抗菌药。溶血葡萄球菌可通过ermA、ermB和ermC基因介导对大环内酯类、林可酰胺类和链阳菌素B耐药(MLSB耐药)，包括结构型和诱导型。该菌可通过主动外排(msrA或msrB基因介导)对大环内酯类和链阳菌素B耐药(MS耐药)，或利用林可霉素核苷转移酶(linA/linA′基因介导)灭活林可霉素和克林霉素(体外仅对林可霉素高耐，对克林霉素表现敏感)，给临床抗感染治疗造成极大困难［1］。本研究调查深圳市人民医院新生儿分离溶血葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药特点及基因型，为临床防治该菌感染提供基础。

1 材料和方法。

1.1 菌株来源。

2002年1月～2005年12月深圳市人民医院新生儿科分离的63株溶血葡萄球菌(排除同一病人同一部位重复分离的菌株)，其中来源于血液39株、气管分泌物17株、咽拭子3株、伤口分泌物2株、脑脊液和深静脉导管各1株。菌种鉴定采用VITEK系统(BioMerieux，法国)及常规生化试验。标准株金葡菌B158(mecA+)由北京大学临床药理研究所惠赠。

1.2 抗菌药、药敏纸片、培养基和生化试剂。

抗菌药有苯唑西林［中诺药业(石家庄)有限公司］、红霉素(大连美罗大药厂)、克林霉素(山东方明药业股份有限公司)。药敏纸片红霉素(15μg/片)和克林霉素(2μg/片)及MuellerHinton琼脂(MHA)培养基均为英国OXOID公司产品。TaKaRa TaqTM(5U/μl)、10×Taq酶缓冲液、dNTPs(2.5mmol/L)、DNA Marker DL2000均购自大连宝生物有限公司，琼脂糖购自BIOWEST公司，溴化乙啶购自BioRad公司。

1.3 方法。

(1)药敏试验 使用琼脂稀释法检测3种抗菌药对63株溶血葡萄球菌的MIC，检测苯唑西林抗菌活性使用含2% NaCl的MHA，含苯唑西林药敏平板接种后35℃孵育24h，其它药敏平板孵育16～20h，金葡菌ATCC29213作为质控菌，按临床实验室标准委员会(CLSI)2006年标准判断结果。采用D试验检测大环内酯类诱导型MLSB耐药，按KirbyBauer纸片琼脂扩散法测定红霉素和克林霉素的抑菌环直径，纸片中心间距21mm，以克林霉素抑菌环靠近红霉素纸片一侧因拮抗作用出现缺损的边界判定D试验阳性，金葡菌ATCC25923作为质控菌。

(2)耐药基因的PCR扩增。

引物设计与合成 见表1。根据实验设计进行适当修改，引物全部由英骏生物公司合成。

模板的制备 将受试菌接种于MH平皿过夜培养，挑取数个菌落于100μl重蒸水中制成菌悬液，加入60μl矿物油，95℃煮沸5min，室温冷却，于4℃、14000r/min离心10min，取上清液为模板。使用GeneAmp PCR System 9700(美国ABI公司)进行PCR扩增。