VEGF及MMP7与大肠癌的关系

作者：申兴斌，王瑞婷 ，梅爱敏，金小平，张文斌。

【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP7）表达与大肠癌进展及预后的关系。方法 采用免疫组SP法检测81例大肠癌(CC)中VEGF及MMP7的表达。结果 VEGF的表达与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、Dukes分期呈正相关。而MMP7表达与大肠癌的淋巴结转移、远处转移、Dukes分期呈正相关，黏液癌中表达明显高于高分化腺癌，年龄＜60岁的大肠癌患者MMP7表达显著强于≥60岁者。VEGF与MMP7表达呈正相关。结论 MMP7 、VEGF促进了大肠癌组织的生长和转移，具有协同作用，可作为大肠癌的预后评估因子，联合检测以上指标对评估大肠癌的预后可能更准确。降低MMP7、VEGF的表达和活性可能成为抗肿瘤转移治疗的一个新途径。

【关键词】 大肠癌；血管内皮生长因子;基质金属蛋白酶7；免疫组化。

大肠癌(colorectal carcinoma, CC)是一种常见的消化道恶性肿瘤, 近20年来, 其发病率逐年增加。细胞外基质降解和新生血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必要条件。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）能降解细胞外基质及血管基底膜，可能促进肿瘤细胞的浸润和血管的形成，而MMP7只在癌细胞和异型增生的上皮细胞中表达[1]。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）通过作用于其受体促进新生血管形成等机制可能参与肿瘤的发生、发展[2]。目前国内外联合检测CC中MMP7、VEGF表达的报道较为少见，本实验以81例大肠癌标本作为研究对象，用免疫组化SP法检测VEGF，MMP7的表达，探讨其在大肠癌生长、转移中的作用, 进一步阐述其与大肠癌进展及预后的关系。

1 资料和方法。

1.1 研究对象。

收集承德医学院附属医院肿瘤外科2001年9月～2002年10月手术切除的CC标本81例。其中男性36例，女性45例，年龄30～85岁，平均57.2岁。Dukes分期根据我国补充方法进行：A期18例，B期25例，C期26例，D期12例。发生部位：结肠癌41例，直肠癌40例；大体类型：溃疡型52例，肿块型24例，缩窄型5例；组织分化程度：高分化腺癌22例，中分化腺癌38例，低分化腺癌11例，粘液腺癌10例；浸润未超过固有肌层（propria muscularis,PM）组22例，超过固有肌层组59例；无淋巴结转移组43例，有淋巴结转移组38例；无远处转移组69例，有远处转移组12例。兔抗人VEGF多克隆抗体，SP9000试剂盒购自北京中山公司,鼠抗人MMP7单克隆抗体，SP（Kit9720）试剂盒均购自福州迈新公司.

1.2 SP免疫组化染色。

切片脱蜡入水，3ml/L甲醇过氧化氢作用5 min，非免疫血清阻断30 min，依次加入稀释后(1∶50)I抗(孵育过夜)，Ⅱ抗(孵育30min)，Ⅲ抗(孵育30 min)，期间用PBS缓冲液冲洗，最后于DAB液显色后，复染、脱水、透明、封片，染色时均设立阴性对照(以PBS液代替I抗)和阳性对照已知胃癌阳性切片。

1.3 结果判定标准。

以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，阳性表达的判断按照Volm[3]的判断标准：（1）选染色均匀的肿瘤区，在400倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数，共计数5个视野，取平均值，以着色细胞占视野细胞总数的多少分0～3级;（2）按细胞着色强弱分级亦分为3级。按（1）、（2）值之和判断结果：阴性（－）：0分；弱阳性（+）：1～2分；中度阳性（++）：3～4分；强阳性（+++）：5～6分。

1.4 统计方法。

数据库的建立和数据分析采用SPSS11.0软件。VEGF，MMP7采用秩和检验, 相关性分析采用Spearman等级相关。

2 结果。

2.1 VEGF与大肠癌临床病理特征的关系。

VEGF的着色部位位于癌细胞的胞浆和胞膜，见图1，间质的部分血管内皮细胞亦有少量弱阳性着色，着色强阳性部位多位于肿瘤浸润的边缘，见图2。81例大肠癌标本中80例阳性表达，浸润未超过肌层的22例大肠癌中13例(59.1%)为弱阳性表达, 4例(18.2%)强阳性，而59例浸润超过肌层组弱阳性为8例（13.6%），强阳性31例（52.5%），两组间差异有统计学意义（u=3.982，P0.01）；淋巴结转移组38例中均为阳性表达，其中25例（65.8%）呈强阳性表达，而无淋巴结转移组43例中仅10例（23.3%）强阳性表达，两组比较差别有统计学意义（u=4.277，P0.01）；远处转移组12例中VEGF表达1例中度阳性，11例（91.7%）强阳性，69例无远处转移组中24例（34.8%）强阳性表达， 21例（30.4%）弱阳性，两组比较差异有统计学意义（u=3.501，P0.01）；大肠癌Dukes A～D期，VEGF表达有增高趋势，四组强阳性表达率分别为11.1%，32%，53.8%，91.7%，四组间差别存在统计学意义（H=28.199，P0.01）, B、C、D期与A期相比差别均有统计学意义（P0.01，P0.01，P0.01），B、C期与D期差别亦有有统计学意义（P0.01, P0.05），而B与C期差别不明显，见表1。

2.2 大肠癌中MMP7的表达与大肠癌临床病理特征的关系。

MMP7阳性表达多表现为癌细胞的胞浆中出现棕黄色颗粒，见图3，有5例CC细胞浆和胞核均有着色，见图4。在81例大肠癌组织中79例阳性表达，随着分化程度的降低，MMP7表达增高，四组间MMP7表达有显著差别（H=8.394，P0.05）,两两比较虽然高、中、低分化腺癌间差别不明显，但三组中随分化程度降低强阳性率逐渐升高，见图5。10例粘液腺癌中7例（70%）强阳性，与高分化腺癌有显著差别（P0.01）；淋巴结转移组38例均为阳性表达18例(47.4%)强阳性，无转移组2例阴性，13例（30.7%）强阳性，两组比较差别有统计学意义（u=2.182，P0.05）；远处转移组12例均为阳性表达，其中10例（83.3%）为强阳性，无远处转移组20例（29%）强阳性表达，MMP7在两组间的表达差别有统计学意义（u=3.362，P0.01）。大肠癌Dukes A～D期MMP7的表达呈增高趋势，四组存在显著差别（H=11.175，P0.01）, A、B、C期明显低于D期（P0.01，P0.01，P0.05）；本实验还发现MMP7的表达与患者年龄有关，＜60岁者MMP7表达明显高于≥60（u=2.401，P0.05），见表2。

2.3 MMP7与VEGF在大肠癌组织表达的相关性。

VEGF与MMP7明显相关（r=0.245, P0.05），见表3。

3 讨论。

3.1 VEGF在大肠癌生长及转移过程中的意义。

本实验结果显示VEGF的表达与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移和Dukes分期呈正相关。有研究显示VEGF通过“旁分泌”方式刺激血管内皮细胞分泌纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，参与细胞外蛋白水解和基底膜的降解，有利于血管床的延伸和内皮细胞的迁移，这样形成的肿瘤血表1 VEGF与大肠癌临床病理特征的关系管系统与正常血管相比高度紊乱，过度的分枝、管壁上大量的内皮孔道、囊泡、基底膜的缺失，使得肿瘤血管具有高度的通透性，肿瘤细胞极易穿透血管壁而发生远处转移。随着肿瘤体积的不断增大，浸润的不断加深，肿瘤内部产生的压力挤压肿瘤内部的淋巴管，而VEGF可使肿瘤组织外周的淋巴管扩张，更利于淋巴管收集间质液和从肿瘤表面渗出的脱落肿瘤细胞，促成了淋巴管转移[4]。此外VEGF还通过“自分泌”机制作用于肿瘤细胞上的Flk1刺激肿瘤细胞的生长[5]。Ochiumi T[6]、Lesslie DP[2]等研究提示VEGF可能调控大肠癌细胞的迁移和生存，Tsai[7]等研究认为术前血中VEGF水平与大肠癌的预后明显相关，本组研究结果证明VEGF不仅为肿瘤生长提供营养，同样也促进了肿瘤的转移。