C反应蛋白与肾小管间质纤维化关系研究
作者：李灿 ，金英顺 ，陈瑛，梁哲宇。
［摘要］ ［目的］ 探讨C反应蛋白（CRP）与慢性环孢素A（CsA）肾毒性肾小管间质纤维化的关系. ［方法］ 给雄性Sprague—Dawley大鼠皮下注射CsA4周，建立慢性CsA肾毒性动物模型.采用胶乳增强免疫比浊法、免疫比浊法以及免疫组织化学染色方法检测对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清高敏CRP（hs—CRP）、CRP及肾内CRP的水平;采用三色染色方法观察肾小管间质纤维化程度;以直线相关分析法对CRP与肾小管间质纤维化程度间的关系进行分析. ［结果］ 慢性CsA肾毒性组与对照组血清CRP和hs—CRP的含量水平间无显著性差异，与肾小管间质纤维化程度无相关关系;慢性CsA毒性组大鼠肾内CRP的表达显著高于对照组，与肾小管间质纤维化程度呈正相关（r=0.862）. ［结论］ 慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化与肾内CRP的表达水平密切相关，与血清CRP的含量无关.
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the relationship between C—reactive protein（CRP）and tubulointerstitial fibrosis（TIF）in a model of chronic cyclosporine（CsA）nephrotoxicity.METHODS Chronic CsA nephrotoxicity was induced in Sprague—Dawley rats by administering CsA for4weeks.Serum CRP，high sensitivity—CRP（hs—CRP），and intrarenal CRP of rats in control group and CsA treatment group were evaluated with particle—enhanced immunoturbidometric method and immunohistochemistry.TIF was measured by Masson trichrome stain.The relationship between CRP and TIF was analyzed by the Pearson single—correlation coefficient.RESULTS There were no significant differences in CRP and hs—CRP levels between two groups.Moreover，there was no relationship between serum CRP and TIF，intrarenal CRP expression was markedly increased in CsA—treated rat kidneys compared with control，and that was correlated with the TIF score（r=0.862）.CONCLUSION Intrarenal CRP level but not serum CRP is closely associated with TIF in chronic CsA nephrotoxicity.
Key words:tubulointerstitial fibrosis;C—reactive protein;rats。
C反应蛋白（C—reactive protein，CRP）是在急性炎症病人血清中发现的急性期蛋白，它可通过补体活化、组织损伤及内皮细胞活化等途径放大炎性反应.急性创伤或感染发生时，血CRP浓度急剧升高，可达到正常水平的1000余倍，病情好转时又迅速下降至正常水平.因此，CRP不但被认为是心血管及肾脏疾病的急性相反应指标，而且监测它还可预测相关疾病的病情严重程度 ［1］ .本实验组曾利用动物模型研究发现，长期使用CsA可导致肾脏持续性炎症介质表达的上调及炎性细胞的浸润，此炎症反应与肾小管间质纤维化密切相关 ［2～4］ .本研究通过检测大鼠血CRP水平，探讨了其与慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化间的关系.
1 材料与方法。
1.1 动物模型的构建 取雄性Sprague—Dawley大鼠16只，体重为200～220g，喂饲低盐饲料（0.5g/L钠盐，Teklad Premier，Madison，WI，美国），随机分为对照组及慢性CsA肾毒性组，每组各为8只.给对照组大鼠每日皮下注射1mL/kg橄榄油（Sigma），给慢性CsA肾毒性组大鼠每日皮下注射15mg/kg CsA（Novartis Pharma，Basel，瑞士），时间为4周.
1.2 肾功能测定 将大鼠放入代谢笼中，采血，收集24h尿液，用7150型全自动生物化学分析仪测定血清肌酐（Scr）含量，用Jaffe比色法测定24h尿肌酐含量，用下列公式计算内生肌酐清除率（creatinice clearance，Ccr）: Ccr（%）=24h尿量×尿肌酐 血清肌酐 ×100。
1.3 血清CRP含量的测定 采用胶乳增强免疫比浊法检测血清hs—CRP，CRP含量 ［5］ .由韩国天主教大学江南玛丽医院梁哲宇教授提供原始数据.
1.4 肾脏病理检查 用碘酸—赖氨酸—多聚甲醛液（periodate—lysine—paraformaldehyde，PLP）固定大鼠肾组织，石蜡包埋后切片，厚度为4μm，脱蜡，行三色染色.肾小管间质纤维化程度判定:每张切片至少观察20个非重叠区域，用数字显微镜分析仪（Olympus，日本）以每个视野为100%利用Polygon。
程序计算出纤维化百分率，并计算其平均值. 1.5 免疫组织化学染色 将石蜡包埋的切片置于二甲苯脱蜡，梯度酒精中脱水，在室温下经3g/L过氧化氢及100g/L甲醛处理30min，用PBS洗涤3次，置于微波炉中加热5min（抗原修复），用PBS洗涤3次，室温下滴加非免疫性血清封闭液处理20min，用PBS洗涤3次，在4℃条件下滴加一抗（ED—1，Sigma，美国），在室温孵育12～16h，用PBS液洗涤3次，滴加二抗，继续孵育2～3h，以DAB为底物显色至颜色呈棕黄色为止;自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片，用数字显微镜分析仪计数ED—1，CRP阳性细胞数.
1.6 统计学处理 计量资料用均数±标准偏差表示（x±SD），两样本均数间比较采用t检验.CRP含量与肾小管间质纤维化程度的关系的分析用直线相关分析，采用SPSS12.0软件进行.
2 结果。
慢性CsA肾毒性组大鼠肾功能明显降低，表现为Scr为（109.3±11.7）μmol/L，与对照组大鼠的（57.1±1.9）μmol/L相比明显上升，Ccr为（1.5±0.2）mL・min —1 ・kg —1 ，与对照组大鼠的（5.1±0.6）mL・min —1 ・kg —1 相比明显下降，两组Scr，Ccr值间均有显著性差异（P0.01）.慢性CsA肾毒性组大鼠肾组织肾小管间质纤维化百分率为36%±3%，而对照组大鼠则无肾小管间质纤维化（图1）;慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质内可观察到大量的ED—1阳性细胞浸润（54个±9个），与对照组（11个±1个）比较有显著性差异（P0.01，图2）;对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清CRP含量分别为（21.6±1.14），（21.6±1.13）mg/L，Hs—CRP含量分别为（2.4±0.09），（2.5±0.19）mg/L，两组间无显著性差异（P0.05）;免疫组织化学染色结果表明，慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP表达及免疫活性明显增强，CRP阳性细胞数为（62±6）个，集中于受损区域的肾小管上皮细胞，对照组为（24±2）个，两组间有显著性差异（P0.01，图3）.直线相关分析结果表明，血清CRP，hs—CRP含量与肾小管间质纤维化程度无相关关系（r=0.054，P=0.844;r=0.027，P=0.919），而肾内CRP阳性细胞数与肾小管间质纤维化程度有较强的正相关关系（r=0.862，P0.001）. 图1 三色染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质纤维化 ×100 图2 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒 性组大鼠肾小管间质炎性细胞浸润 ×400 图3 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP的表达 ×100。
3 讨论。
慢性CsA肾毒性是在肾疾病中较常见的并发症，特别在肾移植病人中的发病率占慢性移植肾肾病的6% ［6］ .本研究利用慢性CsA肾毒性动物模型，检测了慢性CsA肾毒性肾疾病大鼠系统及局部CRP含量，分析了CRP与肾小管间质纤维化程度间的关系，结果表明对照组和慢性CsA肾毒性组大鼠血清CRP，hs—CRP水平无显著性差异，但慢性CsA肾毒性组肾内CRP表达和免疫活性却明显增 强.相关分析结果表明，肾内CRP阳性细胞数与纤。