[急性低氧及力竭运动对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD和myogenin,基因表达的影响]SD大鼠线粒体骨骼肌活性氧测定

摘 要: 目的:研究急性低氧及力竭运动对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD和myogenin基因表达 的影响。

方法:取健康SD雌性大鼠80只,随机分成四大组:1) 常氧对照组(C);2) 常 氧力竭组(NE);3) 低氧对照组(HC);4) 低氧力竭组(HE)。

采用半定量反转录聚合 酶链式反应(RT�PCR)法,测定各组骨骼肌成肌调节因子MyoD和myogenin的mRNA基因表 达。

结果:力竭运动(NE组)引起的MyoD及 myogenin基因表达最为明显(P 　　先进行总RNA提取、逆转录(RT)(按试剂盒说明书),然后进入PCR反应。

PCR过程: 　　1)20 μL PCR反应体系:10×PCR buffer 2 μL, dNTP 0.5 μL, Pex 3ant 1 μL,Taq酶0 .2 μL, MgCl2 2 μL, ddH�2O 7.3 μL, 上、下游引物各1 μL(10 μM),cDNA模板5 μ l(β—actin内参用1 μL量)。

2) PCR反应条件:预变性:94℃ 10 min,变性:94℃ 45 s, 退火: 55℃ 45 s,延伸:72℃ 1 min,72℃ 10 min。

3) 琼脂糖电泳:5—10V/cm,约1 h。

用英国Amersham 公司的ImageMaster VDS analyzer 凝 胶成像系统扫描分析。

1.3 统计分析 　　所有数值以“均数±标准差”表示。

统计分析用SPSS 11.0软件完成,各组间的两两比较采 用方差分析的LSD方法,结合Excel方法作图;某些情况下用采用独立样本t检验,P0.05)。

另一指标,常氧力竭组(NE)和低氧力竭组(HE)的myogeninmRNA含量亦明显升高(P2max的耐力运动引起的变化不如阻力运动明显。

本研究结果显示,力竭运动(NE)引起的MyoD及myogenin基因表达最为明显,在力竭后12h 达峰值。

这可能与力竭运动导致的肌损伤较重有关,因为成肌调节因子特别是MyoD及 myoge nin对肌细胞再生及修复有重要作用,而力竭运动作为一种强刺激可导致肌肉微细损伤,触 发成肌调节因子(MRFs)的表达及修复机制。

高淑杰等(2003)将健康大学生进行外固定腿2周,使肌肉接近废用性萎缩,并在固定期和 恢复期 10周过程中连续补充肌酸和抗阻训练[9]。

结果显示,骨骼肌表达的生肌调 节因子MyoD 、Myf 5的变化与股外侧肌各亚型的的增粗具有一致的结果,Myogenin变化不显著。

Si u等(2004)报道[10],耐力训练8周后,大鼠比目鱼肌中myogenin及氧化酶基因表 达明显提 高,且二者成正相关。

其中myogenin mRNA升高25%,myogenin/ MyoD mRNA比值升高28%;We stern Blot 分析显示,蛋白水平亦有相应的增高。

曾缨等(2004)探讨了成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态表达[2] ,结果MyoD在肌肉损伤后18 h开始表达,48 h达高峰;myogenin在肌肉损伤后24 h开始表达,7 2 h达高峰。

可见MyoD与myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用,可作为鉴定肌肉前 体细胞和反映肌肉再生的指标。

3.2 低氧对成肌调节因子(MRFs)的影响 　　关于低氧对成肌调节因子(MRFs)的影响报道较少。

Anna等(2004)报道,低氧可通过加速 MyoD降解而抑制成肌细胞分化,成肌细胞暴露于低氧下会强烈抑制多核肌管的形成和分化标 志物的表达,即低氧能可逆性地抑制MyoD、Myf5、myogenin的表达,从而抑制成肌细胞分化 [4]。

本研究结果,单纯低氧条件(HC)3 d后,可引起MyoD基因表达明显升高,但各时间点差异 不显著;另一方面,myogenin基因表达变化不显著,只有一个较小幅度的波动性升高,并未 见到低氧对成肌调节因子(MRFs)的明显抑制,可能与不同的低氧实验模型有关,本实验条 件为急性低氧。

此外,低氧暴露加力竭运动后(HE),myogenin基因表达较增加明显,力竭后12 h达峰值, 但MyoD基因表达升高并不显著。

可见两种因子的表达机制存在一定的差异,也可能由于两种 较强因素的刺激加在一起,超过了组织的承受力,干扰了正常的表达机制,从而使MyoD的表 达受到抑制。

也可能在此复合条件下低氧对其有一定的抑制效应,这方面的研究还有待进一 步进行。

Zhong Yun 等(2005)观察了低氧条件下适应性的肌再生[11]。

先前的研究已指出 ,缺血性 损伤后,成肌细胞能分化并修复肌肉损伤,但在缺血微环境下低氧或葡萄糖缺乏如何影响成 肌细胞分化还不清楚。

该研究发现肌再生能适应低氧环境,这种适应机制伴随着起始阶段的 MyoD、myogenin基因表达的抑制,以及随后的氧气依赖性的表达恢复。

低氧对MyoD转录的调 节与组蛋白相应的去乙酰化有关,组蛋白又与MyoD启动子有关。

值得重视的是,与其它细胞 不同,低氧下的成肌过程不依赖于低氧诱导因子(HIF—1)。

研究指出,缺血的肌肉可以经 成肌前体细胞的适应性分化而得到修复,但依赖于缺血微环境的O2及葡萄糖水平。

另外,目前关于成肌调节因子(MRFs)的研究多侧重于失神经支配后肌肉萎缩的研究[12] ,肌损伤模型及肌瘤的研究[13],以及MRFs基因转导方面的研究,关于低氧及运动 对其影响的报道较少,此方面的研究应该引起足够的重视,以便更好地开展工作。

4 小 结 　　 　　本文研究了急性低氧及力竭运动对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD和myogenin基因表达的影响。

结果显示:力竭运动(NE组)引起的MyoD及 myogenin基因表达最为明显,在力竭后12h达 峰值。

单纯低氧条件下(HC组)3 d后,可引起MyoD基因表达明显升高,而低氧暴露加力竭 运动后(HE),myogenin基因表达明显升高。

提示成肌调节因子(MRFs),特别是MyoD及 m yogenin在运动及低氧导致的骨骼肌损伤及修复中起着重要作用。

参考文献: 　　[1] Grace KP, Janice AD,et al. Regeneration of Transgenic Skeletal Mu scles with Altered Timing of Expression of the Basic Helix—Loop—Helix Muscle Reg ulatory Factor MRF4[J].America Journal of Pathology,2003,162:1685—1691. 　　[2] 曾缨,张成,刘克玄,等.成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程的动态 变化[J].第一军医大学学报,2004,24(5):542—545. 　　[3] Willoughby DS, Rosene JM. Effects of oral creatine and resistance trainingon myogenic regulatory factor expression,2003,35(6):923—929. 　　[4] Anna DC, Roberta DM, et al. Hypoxia Inhibits Myogenic Differentiation thro ugh Accelerated MyoD Degradation[J].J Biol Chem,2004,279(16):16332—16338 . 　　[5] F.奥斯伯,等著,颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出 版社,2001. 　　[6] Smith TH, Block NE, et al. A unique pattern of expression of the four musc le regulatory factors distinguishes somitic from embryonic, fetal, and newborn m ouse myogenic cells[J].Development,1993,117:1125—1133. 　　[7] Psilander N, Damsgaard R, Pilegaard H. Resistance exercise alters MRF andIGF—I mRNA content in human skeletal muscle[J].J Appl Physiol,2003,95(3 ):1038—1044. 　　[8] Yang Y, Creer A, Jemiolo B, Trappe S. Time Course of Myogenic and Metaboli c Gene Expression in Response to Acute Exercise in Human Skeletal Muscle[J]. J Appl Physiol,2004 Dec 23. [Epub ahead of print] 　　[9] 高淑杰,等.补充肌酸和抗阻训练促进人体股外侧肌废用性肌肉萎缩恢复的组织化学 和生物化学机制研究[J].沈阳体育学院学报,2003,(1):36—39. 　　[10] Siu PM, Donley DA, Bryner RW, Alway SE. Myogenin and oxidative enzyme gen e expression levels are elevated in rat soleus muscles after endurance training [J].J Appl Physiol,2004,97(1):277—285. 　　[11] Zhong Y, Qun L, and Amato JG. Adaptive Myogenesis under Hypoxia.Molecula r and Cellular Biology, 25(8): 3040—3055. 　　[12] 沈燕国,徐建光.成肌调节因子MyoD和Myf—5在人体失神经骨骼肌中的表达及其临床 意义[J].复旦学报(医学版),29(4):264—267. 　　[13] 信明军,施诚仁.儿童横纹肌肉瘤中Myogenin蛋白的检测及其诊断价值[J].临床肿 瘤学杂志,2004,9(2):126—130.