白细胞介素8基因251A/T多态性与急性胰腺炎的关系
【摘要】 目的探讨白细胞介素8(IL8)启动子区域251基因多态性及血浆IL8水平与急性胰腺炎合并全身炎症反应综合征(SIRS)的关系。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析方法(PCRRFLP)测定71例急性胰腺炎(AP)患者[轻型(MAP)36例,重型(SAP)35例]IL8251A/T的基因多态性,酶联免疫吸附法检测血浆IL8水平。结果IL8251A/A+A/T基因型出现的频率在SAP组和MAP组存在差异,AP组和对照组差别无统计学意义;AA基因型AP组和对照组差别有统计学意义;各基因型出现频率在AP是否合并SIRS组差别无统计学意义。各组血浆IL8水平差别有统计学意义。IL8251基因多态性与血浆IL8水平有相关性。结论IL8251基因多态性可能是AP病情进展的危险因素;IL8251基因多态性可影响血浆IL8水平,血浆IL8水平与AP病情程度有关。
【关键词】 白细胞介素8 基因 多态性 制性片段长度 急性病 胰腺炎。
急性胰腺炎(AP)尤其是重症急性胰腺炎(SAP)在发生发展过程中常合并全身炎性反应综合征(SIRS)及多器官功能障碍综合征(MODS),并导致死亡。一般认为促炎细胞因子在发病过程中发挥重要作用,白细胞介素8(IL8)在AP时表达明显增加,有合并SIRS的尤为明显[1],与疾病严重程度相关。笔者探讨IL8251A/T基因多态性及IL8水平与AP的关系。
1对象与方法。
1.1对象选择2005年8月~2007年1月的住院患者71例,男性33例,女性38例,年龄(46.3±14.3)岁(20~75岁)。其中轻型(MAP)36例,SAP 35例;合并SIRS组34例,无SIRS组37例。在SAP组中,Ⅰ型15例,Ⅱ型10例。AP诊断标准参照文献[2];SAP诊断依据APACHE Ⅱ评分≥8分,Balthazar CT评分≥4分[3];SIRS诊断依据文献[4]。为使入选者在基因学上具有一致性和可比性,所有研究对象都是汉族,且排除以下情况:(1)年龄75岁;(2)白细胞0.4×109 L—1;(3)正在应用免疫抑制剂;(4)慢性胰腺炎。随机选择70例健康体检者作为对照组,男性39例,女性31例,年龄(48.9±15.1)岁(28~85岁)。各组间性别及年龄比较差别无统计学意义。
1.2方法。
1.2.1测定血浆IL8取外周血后,EDTA抗凝,离心,置于—70 ℃冰箱(Fax2100,美国Stat公司)保存以待统一测定。应用酶联试剂盒(深圳晶美生物制品公司)、酶标仪(EL311S型,美国BIOTEK公司)测定IL8。
1.2.2提取基因组DNA取外周静脉EDTA抗凝血3 mL,红细胞裂解液收集白细胞,酚/氯仿法提取基因组DNA,用适量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与乙二胺四乙酸二钠的配制液(TE)或双蒸水溶解,置于—70 ℃冰箱保存。
1.2.3基检测因多态性应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测,先用PCR技术扩增IL8启动子上游108 bp片段,引物设计参照文献[5]:。
上游P1: 5’TTCTAACACCTGCCACTCTAG3’。
下游P2: 5’CTGAAGCTCCACAATTTGGTG3’。
引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应在PCR仪(PTC200,美国MJ Research公司)上进行,反应体系25 μL,TaqDNA聚合酶2 U,dNTP 200 μmoL/L,引物P1,P2浓度20 pmoL/L,模板DNA 50~100 ng,反应条件为94 ℃预变性4 min→94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s,循环35次,72 ℃延伸7 min(美国TaKaRa公司)。PCR产物经2%琼脂糖电泳,溴化已啶染色,紫外透射仪观察,扩增成功DNA片段(108 bp)。PCR产物取10 μL,加10×buffer 2 μL,加限制性内切酶Mfe1 5 U(英国BioLabs公司),在37 ℃水浴消化2~16 h,用3%琼脂糖电泳,溴化已啶染色,紫外透射仪观察分析酶切产物,IL8基因251位点有3种基因型,如为TT纯合子,则1条DNA片段长度为108 bp,AT杂合子3条DNA片段长度分别为108,76,32。
1.3统计学处理采用SPSS 10.0统计软件,计数资料如基因多态性比较用χ2检验,计量资料如血浆IL8水平用t检验,血浆IL8水平用x±s表示。P0.05为有统计学意义。
2结果。
2.1基因多态性检测对象IL8251位点为AA、AT、TT 3种基因型(图1),这种多态性的等位基因频率经检验处于HardyWeinberg平衡状态。