用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱
作者：姜秀良，马加海，张惠，徐礼鲜，杨昌照，田明。
【Abstract】 AIM: To investigate the alteration of gene expression profile of thalamus in rats anesthetized with propofol using gene chip. METHODS: Twelve SD rats were allocated randomly to 2 groups (6 in each group). 9 g/L saline, 100 mg/kg propofol were administered intraperitoneally in control group and propofol group respectively. One hour later, thalamus was dissected and the total RNA was isolated. cDNA was amplified through reverse transcript reaction. Biotinlabeled cRNA was synthesized using cDNA as template. After purification and fragmentation, the cDNA was hybridized with rat neurobiology U34 gene chips. Chips were scanned and genes were analyzed using Microarray Suite Version 5.0 software. Differentially expressed genes were classified according to their biological functions. RESULTS: Among the total 1323 probes detected, 221 genes showed differential expression in propofol group. The expression level of 80 and 141 genes increased or decreased respectively and 53 genes among them had expression level alteration over 2 times. The differentially expressed genes were mainly classified into ion channels, signal transduction, transcription factors and cytokines, etc. CONCLUSION: Propofol can induce a significant alteration of gene expression profile of thalamus in rats. Gene chip is an effective means of studying the underlying mechaninsm of general anesthetics.
【Keywords】 propofol; gene chip; gene expression profile; thalamus; rat。
【摘要】 目的:运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化. 方法: SD大鼠12只，随机分为对照组和异丙酚组，每组6只. 对照组、异丙酚组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg异丙酚. 1 h后，取丘脑，抽提RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA，cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交；杂交后的芯片用扫描仪检测信号，收集图像，用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其作初步功能分析. 结果：1323条待测基因中，异丙酚麻醉后221条基因差异表达，上调表达80条，下调表达141条，其中差异表达超过两倍的为53条. 差异性表达的基因功能可分为离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等. 结论：异丙酚麻醉可诱导大鼠丘脑众多基因的差异表达，基因芯片是研究全麻机制的有效方法.
0引言。
全麻药作用于中枢神经系统(central nervous system, CNS)的确切机制目前仍不清楚［1］. 异丙酚主要是引起意识消失、体动反射消失和学习、记忆功能丧失等全麻效应. 近年来，又证实其具有镇痛、镇吐、脑保护及抗惊厥等作用. 基因芯片技术具有高通量、并行性和快速准确的优点，已应用于药物作用靶位和机制的研究［2］. 丘脑是中继外周伤害性信息的主要部位之一和全麻药作用的重要脑区［3—5］. 我们运用基因芯片研究异丙酚麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化，探讨异丙酚的CNS作用机制.
1材料和方法。
1.1材料成年健康雌性SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)12只，体质量195～223 g，实验前将大鼠放置在安静、避强光的环境中饲养48 h以上. 随机分为对照组和异丙酚组，每组6只. 异丙酚组大鼠腹腔注射100 mg/kg异丙酚（Astra Zeneca），对照组注射同等体积的生理盐水.
1.2方法。
1.2.1取材腹腔注射1 h后，大鼠断颈处死，取全脑组织，置于冰上，切取丘脑，切成0.3~0.5 cm小块，置于盛有RNAlater（Qiagen）的冻存管中，—20℃保存.
1.2.2RNA抽提、探针制备和芯片杂交简要步骤如下：用TRIzol Reagent（Invitrogen）试剂盒抽提丘脑组织总RNA；以RNA为模板，合成单链及双链cDNA；再以双链cDNA为模板，体外转录合成生物素标记的cRNA；cRNA用RNeasy（Qiagen）试剂盒纯化后，进行片段化处理，而后与测试芯片Test3（Affymetrix）预杂交进行质控；符合要求后分别与两张大鼠神经生物学表达芯片U34（Affymetrix）杂交；洗脱处理后染色，以G2500A GeneArray Scanner（Affymetrix）扫描检测信号，收集图像.
统计学处理:应用Microarray Suite Version 5.0软件（Affymetrix）分析某基因是否有表达，以及在异丙酚组和对照组表达程度是否有差异. 两组基因的差异性表达用两张芯片上对应探针之间的荧光信号强度比值的对数（Signal Log Ratio，SLR）表示，SLR表示异丙酚组较对照组某基因表达上调或下调倍数的以2为底的对数值. 根据基因编码蛋白的功能对差异表达超过两倍的基因进行了初步分析.表1异丙酚麻醉大鼠丘脑表达上调两倍以上基因（略）。
2结果。
2.1动物行为学对照组大鼠活动自如，异丙酚组大鼠注射异丙酚后，翻正反射消失，取材时仍未恢复.
2.2基因芯片异丙酚组和对照组分别有647条、692条基因表达，分别占芯片上探针总数（1323）的48.9%和52.3%. 与对照组相比，异丙酚麻醉后221条基因差异表达，其中上调表达80条，占总探针数的6.0%，超过两倍的为27条；表达下调的基因为141条，占总探针数的10.6%，超过两倍的为26条. 差异表达超过两倍（SLR≥2）的基因（表1，2）.表2异丙酚麻醉大鼠丘脑表达下调两倍以上基因（略）。
2.3基因生物学信息分析除去5条功能未知基因，根据基因编码蛋白的功能对其它差异表达超过两倍的基因进行了初步分析，可分为离子通道基因、信号转导相关基因、转录相关基因、细胞因子基因、突触功能基因、细胞结构基因等.