柳茶多糖的分离纯化及气相色谱—质谱分析
作者：石磊，张冬梅，齐洁，李建银，杨永建。
【摘要】 目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进行分离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脱色，逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱—质谱法对其化学成分进行分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏，可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。
Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the water—soluble polysaccharide from Liucha and analyze the chemical composition of liucha.MethodsThe liucha was extracted in hot water， then the polysaccharide in the filtrate was fractionally precipitated by alcohol，after that the proteins in the precipitated product were removed by Sevag reagent，hydrogen peroxide decolor， the hydrolysate of polysaccharide was dialyzed by the reverse flow to get the fine product. Finally， the chemical compositions of the fine product after derivatization were examined by the gas chromatography—mass spectrometric analysis.ResultsThe polysaccharides are composed of ribose，mannose，glucose and galactose.The major monosaccharide components are ribose， galactose and glucose.ConclusionThe method reported in this paper is simple，and can be used for analysis of monosaccharides hydrolyzed from Liucha polysaccharide.
Key words： Liucha polysaccharide; Purify; Gas chromatography—mass spectrometry; Monosaccharide。
柳茶为藏族民间常用药，以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand—Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药，主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载，柳茶主治热病和疫病[1]。现藏族民间常作茶饮，治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良，每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外，通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被许多人接受，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未能开发成药物，主要原因是多糖的分离纯化困难，技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提取、纯化、组分分析进行研究并对其营养保健功能进行探讨，以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。
1 仪器与材料。
1.1 仪器 UV—2450紫外分光光度计(日本岛津) ; NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent 5793I—6890气相色谱—质谱联用仪(GC—MS);SE—54弹性石英毛细管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高纯氦(纯度≥99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。
1.2 材料 鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3 200 m以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand—Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的叶。
单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品 (Fluka公司)，盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯，蒸馏水为实验室自制。
2 方法。
2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90～100℃提取3次，3 h/次，合并水提液，过滤。70℃水浴减压浓缩至适量，加入5倍量95 %的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，置真空冷冻干燥得柳茶多糖粗品。
2.1.2 粗多糖纯化[2]将多糖粗品溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8，滴加H2O2，50℃保温脱色2 h，减压浓缩，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻干燥得去蛋白多糖纯品。
2.1.3 紫外光谱分析 取柳茶多糖适量，加水溶解，配制成浓度为1.0 g/L的多糖水溶液，采用紫外可见分光光度法190～700 nm范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200 nm处有一锐细吸收峰，大于250 nm无明显的紫外吸收，是平坦的背景。结果表明，提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。