大鼠原位肝移植胆道外引流及胆汁采集方法的改进与评估
作者：陈耿 张玉君 杨程 郑树国 李昆 李晓武 董家鸿。
【摘要】目的 改进传统的大鼠肝移植胆道外引流及胆汁采集方法，为肝移植术后胆道问题的研究提供更加符合生理的动物模型。方法 47例大鼠原位肝移植，其中27例采用改进术式（实验组）:在传统肝移植胆道外引流的基础上，加行空肠造瘘，并在体外建立胆汁回流通路，术后通过自制的限制性大鼠笼固定大鼠以便采集胆汁;其余20例仅单纯行肝移植术（对照组）。结果 实验组手术成功率 96.3% ，术后1、2周动物存活率分别为85.19%、81.48%，与对照组接近。两组大鼠术后胆汁 γ—GT 、ALP、总胆汁酸及主要胆盐水平差异均无统计学意义。结论 通过加行空肠造瘘及建立体外胆汁回流通路，能够在不显著加重胆管损伤的情况下有效维持肠肝循环。该模型比较符合生理，易于标准化，为研究肝移植术后免疫排斥和胆道问题创造了良好的条件。
【Abstract】 ObjectiveTo modify the traditional methods for external bile drainage and the bile col—lection in rat orthotopic liver transplantation （OLT） model. MethodsOf 47 rat OLTs， 20 were per—formed with conventional two—cuff technique （control group）， 27 were combined with external bile drain—age and enterostomy （experimental group）. In the experimental group，a self—made connector was used to rebuid in vitro bile flow bypass， and all rats were placed in self—made restraining cages for bile collection. ResultsThe successful rate of OLT in the experimental group was 96.3%， and the posttransplant 1—week and 2—week survival rates was 85.19% and 81.48% respectively， which was comparable to the control group. There were no significant difference in bile γ—GT， ALP， total bile acid and major bile salts levels between these the two groups. ConclusionsThe modified technique of rebuiding in vitro bile flow bypass can maintain the enterohepatic circulation effectively without the aggravation of bile duct injury. This modified rat OLT model is physiological and easy to standardize.
【Key words】liver transplantation; biliary extra—drainage; bile collection。
在肝移植生理与病理研究中胆汁分析是不可 或缺的重要项目。 然而在传统的大鼠肝移植模型基金项目: 本课题受国家自然科学基金资助（No.30571834）中，胆汁的采集一直是一个棘手的问题。不仅采样甚为不便，而且严重干扰了生理状态下的肠肝循环，直接影响到胆汁的组成，最终导致实验结果的偏倚［1］。针对上述问题，我们对经典的大鼠肝移植胆道外引流模型进行了改进及评估，使之更符合生理，更适合肝移植术后免疫排斥及胆道相关问题的研究。
1 材料与方法。
1.1 材料健康、成年、雄性、清洁级SD大鼠250～300 g，购自上海西普尔必凯实验动物公司。受者体重略大于供者。术前12 h禁食，不禁水。肝下下腔静脉、门静脉袖套采用5～7 F动脉鞘导管制成，胆道外引流管采用直径1.2 mm的人体硅胶管，空肠造瘘管采用直径1.5 mm的人体硅胶管（上海新亚医用橡胶厂生产），引流管体外连接器采用7号头皮针制成。XTS—4双人双目手术显微镜1台，显微外科手术器械1套。8—0和11—0医用无损伤缝合针线。
1.2 原位肝移植模型的建立动物麻醉后取仰卧位，常规脱毛、消毒，上腹横切口入腹。通过阴茎背静脉注射125 U/ml肝素生理盐水2 ml进行肝素化。穿刺腹主动脉前壁，通过输液泵以1.5 ml/min的速度缓慢灌注20 ml 4 ℃ UW液。剪开下腔静脉及胸腔段腔静脉作为灌注液流出道。待肝脏质地呈均一土黄色时开始游离肝脏。切断肝周各韧带，双重结扎并切断左膈下静脉、食管支、右肾上腺静脉及右肾静脉，游离下腔静脉。紧贴膈肌环剪断肝上下腔静脉，结扎切断肝动脉，在门静脉和脾静脉汇合处切断门静脉，于左肾静脉上方切断肝下下腔静脉，于胆总管中下1/3处横断。将离体肝脏置于4 ℃ UW液冷浴中保存并安装袖套。受者手术时，麻醉方法、体位及切口均同供者手术。在Kamada等［2］和何晓顺等［3］经典“二袖套”法的基础上进行改良，施行原位 肝移植。
1.3 胆道外引流方法的改进将直径1.2 mm人体硅胶管插入供肝胆总管至肝管汇合处下方，5—0丝线双重固定，并在距胆总管2～3 cm处再固定一次，以防其扭转。于上段空肠造口，直径1.5 mm人体硅胶管向远端插入约1.5 cm，造口处荷包缝合固定引流管。林格氏液冲洗腹腔，将胆道引流管和空肠造瘘管分别穿过两侧腹壁肌层并在肌层再次固定。将受鼠头部轻轻抬起，用20号静脉穿刺针从受鼠头部两耳之间穿刺，穿刺针于皮下潜行直至从切口侧缘皮下穿出，分别将胆道引流管和空肠造瘘管插入穿刺针，同时缓慢退针即可将管道从通过皮下从头部穿刺点处引出。用自制的连接器在体外将两根管道对合（图1）。通过阴茎背静脉补液1ml。确认腹腔无出血、引流管通畅并固定无误后，全层关腹，碘伏消毒切口。
1.4 术后胆汁采集及生化检测术后对受鼠进行复温，至其完全清醒并能活动后，移至单笼饲养，自由进食水，不用免疫抑制剂及抗生素。我们自行设计制作了限制性大鼠笼（re—straining cage for rats）用于实验组大鼠胆汁的采集（图1）。采集胆汁时将大鼠固定于其中，打开连接器，在胆道外引流管端接上延长管，延长管末端置于稍低于大鼠身体的位置，利用虹吸作用将胆汁引出。取样后将胆道外引流管与空肠造瘘管连接闭合，大鼠正常活动和进食。对照组大鼠在术后第14天在麻醉状态下剖腹行胆管外引流术采集胆汁。所有胆汁标本均置于—70 ℃冰箱保存。图1 改良的胆道外引流及胆汁采集方式A:空肠造瘘管;B:胆道外引流管;C:延长管γ—谷氨酰转肽酶（γ—GT）检测试剂盒、总胆汁酸（TBA）检测试剂盒均购自上海复星长征医学科技有限公司。采用Beckman U800紫外分光光度 计进行样本的光密度测定。具体操作与结果计算按照试剂盒说明施行。采用柱前衍生反相高效液相色谱法（RP—HPLC）［4］检测胆汁中胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、α—鼠胆酸 （α—MA） 和β鼠胆酸（β—MA）的含量。CA、DCA及CDCA标准品均购自Sigma公司，α—MA和β—MA购自Steraloids公司。 1.5 统计学处理统计处理采用SPSS11.0软件包，计量资料均以 x±s 标准差的形式表示。计数资料采用百分率 （%）表示。对数据进行单因素方差分析（ANOVA）， 采用Student—Newman—Keuls法进行两组资料均数差异的统计学检验。 P 0.05表示差异无统计学意义， P 0.05表示差异有统计学意义。2 结果 实验组27例，采用了原位肝移植+胆道外引流+空肠造瘘的改良术式。对照组20例，仅施行原位肝移植术。供肝热缺血时间均为0。实验组大鼠手术成功率96.3%（26/27），术后24 h动物存活率92.6%（25/27），术后1周动物存活率85.2%（23/27），术后2周动物存活率81.5%（24/27）。24 h内死亡1例，为失血性休克，原因为肝上下腔静脉吻合口后壁出血;术后24 h至1周内死亡2例，原因分别为胆漏和肠道梗阻。术后1周至2周死亡1例，原因为胆道梗阻。对照组手术成功率100%，术后1周及2周的动物存活率分别为90%、85%，死亡的3例中2例为失血性休克，1例为肝功能衰竭（图2）。图2 生存分析实验组和对照组术后14 d的胆汁γ—GT浓度分别为（19.04±4.58）U/L和（15.79±3.32） U/L ，胆汁ALP浓度分别为（101.27±23.87）U/L和（83.12±10.87）U/L（图3）。尽管实验组的胆汁γ—GT与ALP水平均高于对照组，但这种差异并无统计学意义（ P 0.05）。实验组和对照组术后14 d的胆汁酸总量分别为（1 293.52±83.15）μmol/L和（1 243.50±45.87） μmol/L（图3），差异无统计学意义（ P 0.05）。两组大鼠胆汁中CA、DCA、CDCA、α—MA和β—MA等胆盐所占的比重（%）差异无统计学意义（ P 0.05）（表1）。图3 胆汁γ—GT、ALP的浓度 表1 胆汁中主要胆盐所占比重（%）胆盐名称对照组实验组P CA41.2±2.139.1±1.8NS DCA9.2±3.19.6±2.2NS CDCA4.1±0.83.9±1.5NSα—MA6.0±0.55.5±0.4NSβ—MA14.2±2.515.7±1.8NS。