盐酸伊立替康脂质体冻干粉针的制备及其质量评价

作者：邱永宏，戈延茹，王成润，金一。

【摘要】 　　目的： 研究盐酸伊立替康脂质体冻干粉针的制备方法，并对其进行初步的质量评价。方法： 以包封率为评价指标，比较四种不同的脂质体制备方法，对硫酸铵梯度法的制备工艺和处方进行单因素考察，筛选出冻干保护剂，并对冻干粉针进行稳定性影响因素试验。结果： 两种主动载药法制得的脂质体包封率更高；硫酸铵梯度法制备过程中，盐酸伊立替康脂质体的包封率受药脂比、硫酸铵浓度、孵育温度、孵育时间影响较大，受胆固醇磷脂比、空白脂质体外水相除盐方法影响较小；采用5％蔗糖与5％乳糖作为冻干保护剂冻干效果更好；所得冻干粉针对温度、光照较为敏感，也易受湿度影响。结论： 采用硫酸铵梯度法，经处方工艺条件的优化，可以获得较高包封率的盐酸伊立替康脂质体，5％蔗糖与5％乳糖是本脂质体较合适的冻干保护剂，初步的稳定性考察结果表明，本脂质体冻干粉针宜低温、避光、密封保存。

【关键词】 盐酸伊立替康； 脂质体； 冻干粉针； 硫酸铵梯度法； 稳定性。

［Abstract］Objective: To investigate the preparation of irinotecan hydrochloride lyophilized liposomes and to evaluate their quality preliminarily.Methods： Judging by encapsulation efficiency(EE), four different methods for preparing liposomes were compared, the singlefactor test research was applicated to study the formula and the preparation craft, support agents for lyophilization were screened, and the influencing factor test was applicated to study the stability of lyophilized liposomes. Results： High EE of liposomes was achieved by two active loading methods; under the ammonium sulfate gradient method, the EE of irinotecan hydrochloride liposomes was significantly affected by the ratios of drug to lipid, the concentrations of ammonium sulfate, incubation temperature and incubation time, and it was scarcely affected by the ratios of cholesterol to phospholipid or the saltsremoving methods; superior lyophilized powder could be obtained by using 5% sucrose and 5% lactose; the lyophilized powder was sensitive to temperature and illumination, and it was also affected by humidity. Conclusion： With the ammonium sulfate gradient method, after the optimization of the formula and the preparation craft we could get irinotecan hydrochloride liposomes with high EE; 5% sucrose and 5% lactose were suitable support agents for these liposomes. The preliminary assessment of stability showed that the lyophilized liposomes powder should be stored in low temperature, in sealed condition, and away from light.

［Key words］irinotecan hydrochloride; liposome; lyophilized powder; ammonium sulfate gradient method; stability 　　伊立替康(Irinotecan，CPT11)，是一种半合成的喜树碱衍生物，为特异性的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂。为增加伊立替康的水溶性，人们将其制备成盐酸盐［1］，即盐酸伊立替康，已上市的产品主要为盐酸伊立替康注射液（开普拓）及冻干粉针（艾力）。伊立替康是转移性结直肠癌的有效药物，而且具有很广的抗肿瘤谱。Ⅰ期、Ⅱ期临床研究结果表明，该药对化疗抗拒性肿瘤，如非小细胞肺癌、卵巢癌和宫颈癌有肯定疗效；另外它对胃癌、恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌、小细胞肺癌、皮肤癌、胰腺癌也有一定疗效［2—5］。 　　伊立替康抗癌活性强，但不良反应亦较多，常见不良反应为食欲缺乏、恶心、呕吐、腹泻，白细胞和中性粒细胞减少、贫血及血小板减少，脱发和乙酰胆碱能综合征［6—8］。因此有必要改进其现有剂型，来增加它的适应证，减少其不良反应。脂质体作为胶体给药系统的一种，有着靶向、低毒、高效的优点［9,10］，但盐酸伊立替康等水溶性药物脂质体混悬液的稳定性普遍较差，因此本实验将盐酸伊立替康制备成脂质体冻干粉针，以期得到更为安全、有效、稳定的制剂。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品与试剂 　　盐酸伊立替康（连云港杰瑞医化有限公司）；注射用大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；胆固醇（广东南方化玻有限公司进口分装）；Sephadex G50（Pharmacia公司进口分装）；葡萄糖、甘露醇（广东光华化工厂有限公司）；乳糖（新西兰）；磷酸二氢钾（浙江新安化工集团有限公司）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇（色谱纯，国药集团上海化学试剂有限公司）；其他试剂为分析纯。 　　1.2 仪器 　　RE52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（SH2DⅢ，巩义市英峪予华仪器厂）；超声波细胞粉碎机（JY92Ⅲ2D，宁波新芝生物科技有限公司）；精密酸度计（PHS2C，上海雷磁仪器厂）；冷冻干燥机（LGj18，军事医学科学院实验仪器厂）；激光衍射粒度分析仪（Zetasizer 3000HS，英国马尔文公司）；精密电子天平（Sartorius BS110s，德国赛多利斯集团）；磁力搅拌器（851型，上海志威电器有限公司）；LC10 AT 液相色谱仪（日本岛津公司）；DiamonsilTM ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）,C18预柱（4.6 mm×10 mm，5 μm）；紫外分光光度计（TU1800PC/SPC，北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 制备方法的筛选。

1.3.1 薄膜分散法。

称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，旋转蒸发成膜，并继续减压旋转蒸发15 min至乙醚除尽，加入1 mg/ml盐酸伊立替康水溶液10 ml，水化1 h后，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒。

1.3.2 逆相蒸发法。

称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入1 mg/ml盐酸伊立替康水溶液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒。

1.3.3 pH梯度法。

称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入pH=4.0的枸橼酸钠—柠檬酸缓冲液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒，得空白脂质体液10 ml［11］，向其中加入药物粉末10 mg，再用0.44 mol/L的碳酸钠溶液将脂质体液pH值调至7.5，搅拌2 min后，静置20 min，得载药脂质体。

1.3.4 硫酸铵梯度法。

称取大豆磷脂400 mg，胆固醇100 mg，用20 ml乙醚溶解转移至梨形瓶中，加入250 mmol/L的硫酸铵溶液10 ml，超声3 min成初乳，减压旋转蒸发20 min至乙醚除尽，于探头超声下超声15 min（功率450 W，每工作1 s后间歇5 s），过0.22 μm滤膜4次，整粒，得空白脂质体液10 ml，除去此空白脂质体外水相中的盐，再向其中加入药物粉末10 mg，搅拌2 min后，静置20 min，得载药脂质体。

1.4 包封率的测定。

1.4.1 脂质体与游离药物的分离。

采用Sephadex G50葡聚糖凝胶柱（长18 cm，内径1 cm；洗脱液：pH=4.0磷酸盐缓冲液；流速1 ml/min)分离脂质体与游离药物［12］，通过脂质体与游离药物的流出曲线，确定收集流出液1～10 ml为脂质体组分，11～35 ml为游离药物组分。

1.4.2 药物HPLC测定条件的确立。

流动相：甲醇—乙腈—磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.8 g，加水800 ml，溶解后，加三乙胺10 ml，用磷酸调节pH值至4.0，再加水至1 000 ml）（流动相各组分混合比为55∶5∶40）；流速：0.8 ml/min；柱温35℃；检测波长：254 nm；药物峰面积A对药物浓度C(μg/ml)的回归方程：A=21 680.4＋120 913.6 C(r=0.999 97，n=7，线性范围：0.05～50 μg/ml)。

1.4.3 游离药物量的测定。

凝胶柱分离收集而得的游离药物组分，从中吸取20 μl进样，按“1.4.2”项下方法测定。

1.4.4 总药物量的测定。

精密量取载药脂质体1.0 ml，置于25 ml容量瓶中，加入乳化剂OP（聚乙二醇辛基苯基醚）1.25 g，再加“1.4.2”项下流动相稀释至刻度，振摇至液体变澄清，从中吸取20 μl进样，按“1.4.2”项下方法测定。

1.4.5 包封率的计算 　　　包封率＝1—游离药物量/总药物量×100％。

1.5 硫酸铵梯度法制备盐酸伊立替康脂质体处方工艺条件的单因素考察 　　按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，考察不同制备工艺条件（外水相除盐方法，孵育温度，孵育时间）与处方条件（药脂比，胆固醇磷脂比，硫酸铵浓度）对脂质体包封率的影响。

1.6 脂质体冻干粉针的制备。

1.6.1 冻干工艺。

按“1.3.4”项方法制备盐酸伊立替康脂质体，向此载药脂质体混悬液中加入5％蔗糖与5％乳糖，磁力搅拌3 min使糖类溶解，分装至西林瓶，置于冰箱中—20℃预冻4 h，再转至冻干机中—50℃预冻15 h，打开油泵，于—50℃下抽真空12 h，即得脂质体冻干粉针。

1.6.2 冻干保护剂的筛选。

按“1.6.1”项方法制备脂质体冻干粉针，以脂质体冻干后外观、水化难易程度、形态、包封率为评价指标，筛选出合适的冻干保护剂，进一步确立合适的冻干保护剂浓度。考察的冻干保护剂包括：甘露醇、乳糖、山梨醇、海藻糖、蔗糖、葡萄糖以及右旋糖酐［13］。