BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用

;作者：白玉杰，Seetha SV， Vamla B, 高庆生。

【关键词】; 乳腺肿瘤。

Interaction between BRCA2 and the LIM domain only protein FHL2;　　【Abstract】 AIM:; To screen; genes encoding proteins which can interact with BRCA2; via yeast twohybrid system, confirm the interaction and analyze their functional linkage. METHODS:; 3′region of BRCA2 gene was used to construct the “bait” plasmid and to screen the cDNA library of; normal human mammary gland. Coimmunoprecipitation, mammalian twohybrid and Luciferase assay were used to analyze the association and putative function. RESULTS: Many genes encoding proteins interacting; with BRCA2, including the FHL2, were pulled out by yeast twohybrid screening. The in vivo binding and functional relation between BRCA2 and FHL2 was demonstrated; by coimmunoprecipitation, mammalian twohybrid assay and luciferase detection. CONCLUSION:; The interaction and the functional linkage between BRCA2 and FHL2 was confirmed; and which provides; fresh insights into the biological functions of BRCA2.

【Keywords】; breast neoplasms; genes, suppressor, tumor; BRCA2; yeast twohybridization; FHL2;。

【摘要】 目的： 应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因，验证其相互作用并研究其功能联系. 方法： 以BRCA2基因 3′端片段构建酵母双杂交质粒，筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA文库，获得编码相互作用蛋白的基因，采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系. 结果： 采用酵母双杂交系统筛选，获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中包括已知的FHL2蛋白；免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合，并证实FHL2在体内形成同源二聚体；转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用. 结论： 发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系，为BRCA2功能研究提供了新的方向.

【关键词】; 乳腺肿瘤；基因，抑制，肿瘤；BRCA2；酵母双杂交；FHL2。

0引言。

乳腺癌是西方妇女最常见的恶性肿瘤，发病率约为10%［1］，死亡率高达30%［2］. 我国发病率低于西方国家，大约2%—3％，但近年来呈快速上升趋势，在上海、天津及沿海地区已成为女性发病率最高的恶性肿瘤［3］. 目前研究最多的遗传因子是乳腺癌抑制基因BRCA1［4］和BRCA2［5，6］. BRCA2基因突变携带者发生乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌的危险性显著高于正常人群［7］，BRCA2参与双链DNA断裂损伤修复、维持染色体稳定、转录调控等细胞功能［ 8—10 ］. FHL2是1998年Chen等从胎儿心脏cDNA文库克隆的一个单纯LIM结构域蛋白，含4个半LIM结构域而得名（Four and half LIMonly protein2, FHL2）.

我们采用酵母双杂交系统筛选正常人乳腺上皮细胞文库，发现FHL2是BRCA2相互作用蛋白之一，不仅哺乳细胞双杂交证实了体内结合，而且还发现二者有转录激活协同作用，为BRCA2和FHL2的功能研究提示了新的方向.

1材料和方法。

1.1材料HA109酵母细胞；酵母双杂交系统－3全套质粒（pGBKT7, pGADT7 , pCL1, pGADT7T, pGBKT753, pGBKT7Lam）；哺乳细胞双杂交系统质粒(pM, pVP16, pM53, pVP16T, pVP16cp）；酵母培养基（YPDA）及筛选培养基（SD）、多种氨基酸、XαGal,; XβGal, LB培养基、酵母质粒DNA提取kit（clontecl#K16111）等购自CLONTECH 公司；293T细胞购自ATCC（美国组织培养中心）. 毕业论文 ;　　1.2方法。

1.2.1酵母双杂交系统‘钩’质粒的构建以pUC19/BRCA2质粒（哈佛大学Sam Lee博士惠赠）为模板，采用Stepdown PCR扩增BRCA2 3′片段（7900~10 808 bp, C3），并掺入限制性酶切位点, 扩增产物经10 g・L—1琼脂糖凝胶电泳分离，采用DNA回收试剂盒(Qigene公司，美国)回收PCR产物片段及载体pGBKT7质粒DNA. 连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含卡那霉素的LB培养板培养、筛选阳性克隆、提取质粒DNA进行酶切鉴定、序列分析证实.

1.2.2酵母双杂交系统筛选参照MATCHMAKER GAL4双杂交系统3操作流程进行(MATCHMAKER GAL4 TwoHybrid System3 Libraries User Mannual. PT32471, Clontech, USA).

1.2.3哺乳细胞双杂交方法验证BRCA2/FHL2体内结合将BRCA2/C3片段及FHL2基因分别克隆到哺乳细胞双杂交载体pM和pVP16中，Ca3（PO4）2沉淀法转染293T细胞，CO2孵箱37℃培养48 h，收集细胞，采用荧光酶检测试剂盒（CLONTECH公司）检测转染细胞的荧光酶活性.

1.2.4免疫共沉淀法分析FHL2与BRCA2的体内结合分别构建表达含Flag标签的C3和含Myc标签的FHL2的真核载体pEF/BRCA2C3flag (pEF/BRCA2C1/C2两个质粒编码较短的C端片段作为对照)和PCR3.1/FHL2myc, 各用10 μg氯化铯纯化的质粒DNA，磷酸钙沉淀法转染293T细胞. 48 h后收集细胞,用含10 g・L—1 FMSF的LSAB缓冲液溶解，振荡、离心取上清，加入10 mg・L—1 抗Flag单克隆抗体（M9, Sigma公司）4℃孵育过夜， 加入蛋白G微珠, IP缓冲液(50 mmol・L—1 TrisHCl PH8.0, 150; mmol・L—1 NaCl, 5 mg・L—1 NP40, 0.1 g・L—1 BSA, 10 mg・L—1 PMSF)漂洗6次, 90 mg・L—1 SDSPAGE电泳，转移到尼龙膜，用辣根过氧化物酶偶联抗Myc单克隆抗体（Sigma公司）进行Westernblot反应，ECL系统检测.

毕业论文 ;　　1.2.5FHL2对BRCA2基因的转录激活作用pM/FHL2, pEF/BRCA2真核表达载体和pG5luc荧光酶报道质粒共转染293T细胞，CO2孵化37℃培养48 h，用荧光酶检测试剂盒测定转染细胞的荧光酶活性.

2结果。

2.1酵母双杂交筛选质粒的构建pUC19/BRCA2质粒为模板，Stepdown PCR条件为：94℃ 1 min， 68℃/65℃/62℃/59℃/56℃ 1 min,; 72℃ 2 min 各5个循环，随后94℃; 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 进行20个循环. PCR产物经10 mg・L—1琼脂糖凝胶电泳检测，特异性扩增产物分子质量(Mr×103)约为2900，与设计扩增大小相符. PCR产物与经酶切pGBKT7, pGADT7质粒，经连接转化、提取质粒DNA，双酶切鉴定阳性重组质粒，序列测定证实正确.;　　2.2cDNA文库的酵母双杂交筛选用pGBKT7/ C3酵母双杂交‘钩’质粒筛选正常人乳腺细胞cDNA文库，转化效率为0.8×106~9.2×107 cfu・μg—1 DNA，筛选获得阳性克隆68个，BLAST分析在24种已知基因中，包括编码FHL2蛋白的基因全长序列.;　　2.3哺乳细胞双杂交分析pM/C3，pV16/FHL2, pM/FHL2, pV16/C3各10 μg；荧光酶表达报道质粒pG5luc 2 μg共转染293T细胞, 通过检测荧光强度分析蛋白间的相互作用，结果表明FHL2与BRCA2C3片段特异性结合（Fig 1.; pMFHL2+ pVP16C3 共转染293T细胞，LA=3122.2，PMC3+pVP 16FHL2 共转染293细胞，LA=2941.1）；FHL2有自身的内在转录激活作用（pMFHL2+pVP16，LA=570.6）. 而且，FHL2在细胞形成同源二聚体结构（pMFHL2+ pVPFHL2，LA=3129.8）.

毕业论文 　　图1哺乳细胞双杂交验证FHL2与BRCA2C3片段的体内相互作用　(略)。

2.4FHL2与BRCA2体内结合反应采用免疫共沉淀和Westernblot进一步证明了FHL2与BRCA2体内结合（Fig 2）. 转染FHL2myc或/和 BRCA2C3flag质粒的293T细胞裂解液，采用抗Flag抗体免疫共沉淀，抗Myc抗体Westernblot检测，发现FHL2myc和BRCA2C3flag在体内形成复合物，而与较短的BRCA2片段C1, C2不结合或仅有微弱结合， 证实了二者间在体内的特异性结合.