脑损伤大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽的改变
【摘要】 目的 研究脑损伤后大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽(CGRP)的变化及骨痂量的改变。方法 将100只雄性Wistar大鼠随机分为两组，脑损伤加右胫骨骨折组和单纯右胫骨骨折组各50只。术后3、7、14、21、28 d分批处死，检查血清碱性磷酸酶，摄右胫骨X线片测量骨痂面积，骨痂行苏木精2伊红(HE)染色和降钙素基因相关肽免疫组织化学染色。结果 脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后3、7 d，碱性磷酸酶均显著升高(P＜0.01)；脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后14、21 d，骨痂X线面积大；脑损伤组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，骨痂中降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维多，明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞浆内降钙素基因相关肽强阳性表达；骨折愈合快，降钙素基因相关肽表达明显增强。结论 脑损伤后骨痂中降钙素基因相关肽有显著改变，并引起骨痂量和质的改变，推测降钙素基因相关肽参与调节骨折愈合过程。
The Change of Calcitonin Generelated Peptide in Tibial Fracture Callus After Bran Injury in Rats。
Abstract：Objective To study the relationship between the changes of calcitonin generelated peptide in tibial fracture callus and yield of callus after brain injury in rats.Methods One hundred male Wistar rats were randomly divided into brain injury plus tibial fracture group (n＝50) and tibial fracture group (n＝50).The animals were sacrificed in batches 3，7，14，21 and 28 days after operation.The concentration of ALP in serum of rats were measured.Xray plane films of the fractured tibial were taken to measure area of callus.Callus were subjected to HE staining and CGRP immunohistochemical staining.Results Concentration of ALP in serum of brain injury group were significantly higher than those in tibial fracture group at 3 d and 7 d (P＜0.01).The area of callus in brain injury group was larger than in tibial fracture group at 14 d and 21 d.There were a quantity of fibrous callus and cartilaginous callus formation and more CGRP immunoreactive nerve fibers in callus at early stage after brain injury.Strong immunoreactivity of CGRP was found in osteofenitor cells，chondroblasts，which proliferated in thickened endoperiosteal and amidst callus at 3 d and 7 d in brain injury group.The tibial fracture recovers rapidly and CGRP in the callus expresses highly after brain injury.Conclusion CGRP have significant effect on bone fracture healing，the expression of CGRP showed different expression in different period of fracture healing，CGRP increase in callous with brain injured rats.this fact indicated that CGRP were involved in fracture healing.
Key words：brain injury；tibial fracture；CGRP；rat。
临床和实验观察表明，骨的生长及修复受神经因素的影响［1］。众多研究表明，感觉和自主神经纤维分布在骨及骨膜上，其释放的神经肽的增加在骨痂形成的早期即可以测到，神经肽在骨折愈合重建中发挥重要作用。本实验采用免疫组织化学技术和大鼠脑损伤加胫骨骨折的动物模型，研究不同时间点胫骨骨痂中降钙素基因相关肽(calcitonin generelatel peptide CGRP)及CGRP免疫阳性神经纤维的改变和骨痂量的变化，探讨脑损伤后对骨折愈合的影响，以期从分子水平阐述神经因素对骨折愈合的影响及调控，探讨神经肽与骨折愈合的相互作用的调控过程和机制。
1 材料和方法。
1.1 材料 Nikon UFXⅡA显微镜、摄像镜(日本)，HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统(中国武汉)，计算机放射成像系统(Regius model150，日本KONIC公司)，液压脑损伤模型由柳州医疗器械厂制作(参考方加胜教授)［2］，以上设备均由柳州市人民医院提供。主要试剂：试剂。
基金项目：广西科技厅青年基金(桂科青0447055)。
CGRP购于武汉博士德公司。EDTA2NA(乙二胺四乙酸二钠)骨组织脱钙试剂：瑞兴科技有限公司；磷酸盐缓冲液：福州迈新生物技术有限公司(批号701020060v)。检测方法均按试剂盒要求操作，雄性12周龄wistar大鼠100只，体重(500±50) g，Wistar大鼠由广西医科大学试验动物中心提供(实验动物生产许可证号SCXK2003003，清洁级)。实验过程中于室温20℃自然光照的动物房中分笼饲养，供给大鼠标准饲料，自用饮用水，定期紫外线消毒与排风，喂养1周适应环境后随机分为骨折组和骨折合并脑外伤组，两组间无统计学差异。
1.2 方法。
1.2.1 动物分组 3～4个月龄雄性Wistar大鼠100只，体重450～550 g。随机分为两组，单纯右胫骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，每小组10只；脑外伤组加右胫骨骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，每小组10只。
1.2.2 模型制作 术前禁食，大鼠随机分组并称重，经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，常规去毛、备皮、碘伏消毒。显露右颅顶骨，中线旁2 mm处开直径5 mm骨窗，液压打击致中度脑损伤。复苏后，沿胫骨前外侧钝性分离进入到达胫骨干，在胫骨骨干中1/3段用摆锯锯断成横形骨折，以直径1 mm克氏针作逆行髓内固定，经查骨折固定牢固后，生理盐水冲洗，关闭伤口，碘伏再消毒。骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理，术毕分笼饲养。
1.2.3 标本采集和处理 分别将受试大鼠经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，于术后第3、7、14、21、28天心脏取血处死，每组各10只，取血4～6 mL离心后取血清贮存(－70℃)待测；待血清收集齐后一批进行检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量。处死大鼠后立即取带骨膜和少许肌肉的右胫骨，照片后置于装有4％多聚甲醛(pH7.2)瓶中，标明动物编号、日期，放入4℃冰箱中固定24 h。之后取出，充分水洗后，PBS液浸泡30 min，放入10％乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH7.3溶液中脱钙，每周换2次脱钙液，经5周脱钙后，用针头能轻易扎穿骨皮质，则脱钙充分。接着进行骨痂的免疫组化操作步骤。切片与胫骨纵轴垂直，连续切片，间距为6 um。具体步骤参照试剂说明书。
1.2.4 计算机X线摄像仪(CR)摄片 14、21、28 d将大鼠完整的右侧胫骨干骨折标本经CR摄片(距离：90 cm，电压：40 Kvp，电流：3.0 mA)，观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。所得图像运用photoshop7进行处理，计算骨痂面积大小、不同骨痂比例。
1.2.5 免疫组织化学染色图像分析 以目标平均吸光度值为指标对所有标本切片的阳性信号进行量化。标本切片置于光镜下，每个切片选取8个视野，放大400倍后，在相同曝光条件下摄片，同时将图像输入计算机Motic数码医学图像分析系统检测阳性目标平均吸光度。平均吸光度值表示阳性信号的强度。平均吸光度值越大则信号越强，说明着色越深，抗原浓度越大。
主要观察指标：骨折合并脑损伤组与骨折组大鼠术后不同时间点CGRP免疫组织化学染色的平均吸光度值；骨折合并脑损伤组与骨折组大鼠术后不同时间点ALP在血清中的浓度；组织形态学观察，骨痂面积的测量。
1.3 统计处理 运用SPSS13.0软件行统计分析，对相关指标进行t检验和方差分析。P＜0.05表示相比较的组别之间的差异有统计学意义。
2 结 果。
2.1 血清中ALP变化见表1。表1 不同损伤组大鼠各时间点ALP变化。
2.2 X线片观察 将大鼠离体右侧胫骨干CR摄片，观察骨痂的连续性发现，各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象。骨折组骨折线清晰，骨痂量较少；脑外伤组骨性愈合较好，骨痂量较多，骨折线模糊。14、21 d骨痂图像分析(见表2)，14、21 d脑损伤组骨痂面积比单纯骨折组大(P＜0.01)；21、28 d骨痂面积比较，脑损伤组变化明显快于单纯骨折组，提示骨痂塑性快(P＜0.01)。
2.3 组织学观察 胫骨骨折合并脑损伤组早期骨膜明显增厚，骨膜内层形成软骨细胞，纤维骨痂量较多；14 d纤维骨痂表2 两组骨痂面积测定结果 中的软骨细胞团增大，有的融合在一起，软骨内骨化少，骨膜下软骨细胞层增厚；21、28 d仍可见大量纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成，外骨膜下的软骨层尚未完全转变成编织骨。单纯骨折组骨膜反应轻，纤维骨痂量少，膜内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主。