兔肾VX2移植瘤模型的建立及其超声显像检测
作者：王子明，佘军军，程伟，李小鹏，李谦，车向明，韩水平，白卓亚。
【关键词】 超声技术。
摘要：目的 比较建立兔肾VX2移植瘤模型的不同方法的优劣。方法 分别用瘤液穿刺法、瘤块液种植法、瘤块包埋法建立兔肾VX2癌模型。采用超声技术动态检测肿瘤体积及CDFI的变化，确定该模型最佳实验干预时段及其血流参数范围。比较各自的成瘤率；观测肾脏肿瘤的大小及其回声、瘤内血管生成以及血流阻抗等指标。结果 瘤块包埋法可建立稳定的兔肾VX2移植瘤模型。B超可以实时、准确、方便的监测肿瘤体积及血流动力学变化。结论 兔肾VX2移植瘤是一种造模方法简便且成瘤率高的肾癌动物模型，采用超声技术能精确、无创的动态监测肿瘤体积变化及血流特征。
Establishing rabbit VX2 carcinoma model and monitoring it with color Doppler energy ultra sound technique。
ABSTRACT: Objective To compare the advantages and disadvantages of several methods to establish the rabbit VX2 carcinoma model. Methods Ultrasound technique was used to confirm the best periods of experiment on the rabbit VX2 carcinoma mode. The rabbit VX2 carcinoma model was established by different ways, such as tumor cells fluids and tumor block transplanting guided by Bultrasound, tumor block transplanting by operation to compare their successful rate. Kidney size and other indexs were observed. Results Tumor block transplanting by operation was the most successful to establish a steady model. Conclusion The rabbit VX2 carcinoma is one of the biggest animal models for kidney carcinomas experimental research; it is steady and easy to be manipulated.
KEY WORDS: rabbit; VX2 kindey carcinoma; B ultrasound。
小鼠移植瘤模型常被用于肾癌的实验研究，但动物体型小、抗干预能力差，肿瘤原发部位不在肾脏并且成瘤率低，因而其应用受到限制。VX2肿瘤是由Shope病毒诱发的兔可移植性肿瘤，可接种到不同器官而成兔移植瘤模型。我们旨在寻找建立兔肾VX2移植瘤模型的最佳方法，用B超追踪肿瘤生长特征，确定最佳实验干预时段，为评价肾癌的基础研究及治疗疗效提供依据。
1 材料与方法。
1.1 实验材料 新西兰大白兔45只，体质量2.0—2.5kg，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。VX2瘤株由第四军医大学提供。B超检查用美国Acuson 512 型彩色多普勒超声诊断仪。日本Hitachi H600型电子透射显微镜。
1.2 VX2瘤细胞的复苏与培养 按照一般细胞培养技术对冰冻VX2瘤细胞悬液进行复苏后离心5min(800r/min)，除去上清液，加入PBS液用玻璃棒搅匀。取悬液置于RPMI1640培养液中，台盼蓝染色并做死、活细胞计数，将培养液调制成107/mL活细胞浓度。
1.3 动物模型建立 将45只兔随机分为A、B、C 三组，每组各15只。A组采用瘤细胞悬液接种法。兔清醒状态下B超引导穿刺右肾下级并注入瘤细胞液1mL。B组采用瘤块液穿刺种植法。先将上述瘤细胞液2mL分别注入兔双侧后腿皮下即成为荷瘤种兔，两周后肿瘤形成直径约2cm大小时完整切取，去除包膜及坏死组织，剪取肿瘤边缘生长旺盛部分置于Hanks液中。尽量剪碎约1mm，制成瘤细胞悬液。兔麻醉状态下B超引导16G穿刺针进入右肾下级，注入瘤细胞悬液0.3mL。C组采用瘤块包埋法。兔麻醉后俯卧位固定，取右12肋缘下切口3—4cm，暴露右肾下级后用眼科镊穿刺1.5cm深隧洞。在冰块上将前述荷瘤组织剪为直径0.2—0.3cm的小块后植入。明胶海绵压迫止血，生物胶填塞。各组操作均于1.5h内完成。实验动物肌注青霉素40万单位，连续3d。实验期内无1例兔感染或死亡。
1.4 肿瘤的超声检查 用Acuson Sequoia512 型超声仪，15L8W宽频线阵探头(频率为8.0—13.0MHz),分别于肿瘤种植后7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d对实验兔进行多切面扫查，由两名高年资超声医师同时操作。观察肾脏及肾内肿瘤的大小、形态、回声特点,用所测数据计算肿瘤体积(V=0.5a×b2，a和b分别是肿瘤最大直径和与其垂直的最小横径)和肿瘤生长率(tumor growth rate, TGF. TGF=a2b2—a1b1/a1b1×100%)。观察病灶内部和周边血管分布特征，用脉冲频谱多普勒检测血流动力学参数[1]。观察肾门及腹主动脉旁淋巴结变化，是否出现癌栓及液化坏死等。
1.5 病理检查 分别于植瘤后第7、9、11、13、15、17、19、21、23、25d行B超检查，1h后每组各处死1只兔。取肾癌组织戊二醛固定后行透射电镜观察，同时切取原发瘤灶及可疑淋巴结、肝脏、肺脏转移组织进行光学显微镜检查。剩余兔均于第30 天处死。
1.6 统计学处理 各变量保留两位有效数字，以±s表示。统计分析采用t检验和χ2检验。
2 结果。
2.1 成瘤率 A、B、C三组实验兔成瘤率分别为40%、60%、100%。采用χ2检验，C组与A、B组比较有显著性差异(P0.05)，A、B组之间差异不显著(P0.05)，即瘤块包埋法较前两种方法有效。大体标本见兔VX2肾癌为突出于肾脏表面的结节样包块，与周围分界清楚，有完整包膜形成，质地较硬，切面呈鱼肉样(图1)，晚期肾癌标本可见瘤体中央因缺血坏死而成豆渣样，病理显示鳞癌(图2)。
图1 兔肾VX2癌大体标本 （略）。
Fig.1 General specimen of rabbit renal VX2 carcinoma model。
Fig.2 Cells of rabbit renal VX2 carcinoma model (HE×400)。
2.2 肿瘤生长特征变化 三组实验兔不同时间肿瘤体积及其环比增长速度见表1。瘤块包埋组(C组)全部成瘤并且生长稳定，肿瘤形态规则，在植瘤后11—21d，各监测时间体积增长无显著性差异(P0.05)。病检发现当肿瘤体积增至15—20cm3时，肿瘤中央出现液化坏死，周围局部浸润及肝、肺、肾门淋巴结广泛转移。所以实验干预适宜于植瘤后2—3周内进行。
2.3 超声检测肿瘤的体积变化 各组实验兔均于B超检查后即刻处死1只，并实际测量肿瘤大小后计算体积。B超测量体积与肿瘤实测体积(表2)经配对t检验无显著性差异(P0.05)。表明B超可以方便、快速、无创、准确的应用于肿瘤动态监测，筛检合格的实验动物。