紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中PKC
Expressions of PKCα and Pgp in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol。
【Abstract】 AIM: To detect the expressions of Pglycoprotein （Pgp）and protein kinase Cα(PKC α) isoform in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol. METHODS: Immunohistochemical SP method and doublelabeled immunofluorescence were used to determine the expressions of Pgp and PKCα in A2780/Taxol and A2780.Western Blot was employed for assess Pgp expression after A2780/Taxol was cocultured with phorbol myristate acetate(PMA) or staurosporine (SP). RESULTS: There was a coexpression of Pgp and PKCα in A2780/Taxol, but Pgp was not expressed in A2780.And the expression level of Pgp in A2780/Taxol was not affected by the presence of PMA and SP. CONCLUSION: Pgp and PKCα play important roles in the resistance of ovarian cancer cell A2780 to taxol.
【Keywords】 ovarian neoplasms; Taxol resistance, Pglycoprotein; protein kinase C。
【摘要】目的： 探讨PKCα与Pgp在紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞系A2780/Taxol中的表达. 方法： 免疫细胞化学SP法及免疫荧光双标检测PKCα与Pgp在耐药细胞A2780/Taxol及其亲本细胞中的表达； Western Blot检测并半定量分析PKC激动剂佛波脂(PMA)和抑制剂十字孢碱(SP)作用后Pgp在两种细胞上的表达水平. 结果： 免疫细胞化学结果表明在A2780/Taxol中，Pgp与PKC表达均呈阳性，而在亲本细胞中，Pgp不表达，PKC呈阳性表达. 在A2780/Taxol中PKCα与Pgp有共表达. SP及PMA作用后，A2780/Taxol细胞Pgp表达无明显差别. 结论： 卵巢癌对紫杉醇耐药的产生与PKCα和Pgp有关. 【关键词】 卵巢癌，紫杉醇耐药，P糖蛋白，蛋白激酶C。
0引言 紫杉醇在卵巢癌化疗中占有重要地位，而耐药是影响疗效的重要因素. 多药耐药基因(mdr1)编码的P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)的过表达是紫杉醇耐药机制之一，而Pgp是由蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)磷酸化而发挥功能的，在PKC众多同功酶中又以α同功酶(PKCα)与多药耐药(multi drug resistence, MDR)关系最为密切. 因此我们培养紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞，研究其Pgp及PKCα的表达，为逆转耐药提供依据. 1材料和方法。
1.1材料卵巢癌细胞系 A2780及其紫杉醇耐药孕系(A2780/Taxol)由王泽华教授惠赠，培养于含有100 mL/L小牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃， 50 mL/L CO2，相对湿度90% 的培养箱中培养；试剂 DMEM 购于Gibco公司，鼠抗人MDR1 mAb及兔抗人PKCα pAb购于Boster公司，SP免疫组化试剂盒，罗丹明标记的羊抗兔IgG及FITC标记的羊抗鼠IgG购于北京中山金桥生物技术公司，十字孢碱(SP)和佛波脂(PMA)购于Sigma公司.
1.2方法。
1.2.1细胞爬片A2780和A2780/Taxol细胞按2×106个/L浓度接种于装有防脱处理的盖玻片的6孔板中培养24 h，取出爬片，10 mol/L PBS冲洗2次，950 mL/L 乙醇固定10 min，中性树胶黏于载玻片上.
1.2.2免疫组化SP染色取上述细胞爬片，封闭后分别滴加鼠抗人MDR1 mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100), DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片.
1.2.3免疫荧光双染细胞爬片同上，滴加MDR1 mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100)，4℃冰箱孵育过夜，滴加FITC标记的羊抗鼠IgG和罗丹明标记的羊抗兔IgG，PBS振洗，甘油封片. 同时设PBS代替一抗的阴性对照. 1.2.4Western Blot实验分组1组： A2780细胞阴性对照组，2组： A2780/Taxol细胞组；3组： A2780/Taxol细胞+PMA组： 培养A2780/Taxol细胞，PMA浓度200 nmol/L与细胞共同孵育40 min后收集细胞；4组A2780/Taxol细胞+SP组： 培养A2780/Taxol细胞，SP浓度100 nmol/L与细胞共同孵育2 h后收集细胞. 按文献［1］提取总蛋白，Lowry法定量，取20 μg蛋白样品进行SDSPAGE电泳，分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度5%，并电转移至硝酸纤维素膜上，用含10 mol/L BSA的TBST 4℃冰箱封闭过夜，加入兔抗人Pgp pAb（1∶500），室温轻摇60 min，加入羊抗兔APIgG,显色液避光显色2 min，同时，以βactin作内参. Western Blot结果以Image软件做图像弧度扫描，半定量采用与βactin的灰度比计算. 统计学处理： 以SPSS统计软件对结果进行统计分析，采用多样本snkq检验.