卵子激活提高冻融睾丸精子ICSI效率
[摘要] 目的 研究卵子激活能否改善冻融睾丸精子行卵胞浆内单精子注射（ICSI）时的受精率和胚胎发育。
方法 选择2015年1月～2017年6月我院收治的42例行冻融睾丸精子ICSI助孕治疗的患者作为研究对象，按照患者ICSI后是否进行人工卵子激活（AOA）随机分为（普通冻融睾丸精子）对照组（n=23）和卵子激活组（n=19），对两组受精率和优质胚胎数，可利用胚胎数和临床妊娠率进行比较。
结果 与对照组相比，卵子激活组有更高的受精率（53.21% vs 71.65%，P0.05）。
毕业论文网 [关键词] 卵子激活；卵胞浆内单精子注射；体外受精与胚胎移植；受精机制；冻融睾丸精子 [中图分类号] R714；R698 [文献标识码] A [文章编号] 1673—9701（2018）06—0028—03 [Abstract] Objective To investigate whether the activation of ovums can improve the fertilization rate and embryo development in intracytoplasmic sperm injection（ICSI） of frozen—thawed testis sperm. Methods Forty—two patients undergoing ICSI assisted pregnancy with frozen—thawed testis in Jiujiang Maternal and Child Health Care Hospital from January 2015 to June 2017 were enrolled in this study. Patients were randomly divided into（normal frozen—thawed testis sperm） control group（n=23） and oocyte activation ovum—activated group（n=19） according to whether artificial ovum activation（AOA） was carried out， the number of fertile embryos and the number of high—quality embryos， the number of available embryos and the clinical pregnancy rate of the two groups were compared. Results Compared with the control group， the ovum—activated group had higher fertilization rate（53.21% vs 71.65%， P0.05）. Conclusion Ovum activation enhances the ICSI efficiency of frozen—thawed testicular sperm. [Key words] Ovum activation；Intracytoplasmic sperm injection；In vitro fertilization and embryo transplantation；Mechanism of fertilization；Freeze—thaw testicular sperm 卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperminjection，ICSI）技术的应用是辅助生殖技术的又一个里程碑[1]。
ICSI是把单个精子通过显微操作注射到卵子内完成受精，是目前治疗男性严重少弱精子症的最有效的辅助生殖技术，对无精子症患者采用显微外科睾丸精子抽取术（testicularspiration，TESA）获得的极少量的精子也可以取得满意的临床结局，已经成为试管婴儿的常规技术之一。
睾丸精子抽取术是有创手术，给无精子症患者生理和心理创伤，且睾丸精子的有无和活力的好坏和穿刺部位有相关性。
因此，进行诊断性睾丸抽取术时发现有活动精子时??及时把精子冷冻。
冷冻睾丸精子复苏后用于ICSI，可以减少反复穿刺带来的并发症，但由于睾丸精子本身活动力低，冻融后进一步降低睾丸精子的活动力，因此受精率、胚胎发育和临床结局均不如新鲜睾丸精子[2]。
虽然有部分研究如何从不活动的精子中筛选活精子的方法，但效果不一[3]。
卵子激活技术能有效提高精子激活卵子不足导致的受精障碍[4，5]。
本研究比较了卵子激活技术对冻融睾丸精子的受精和胚胎发育，临床结局的影响，旨在为临床进一步应用提供依据。
1 资料与方法 1.1 临床资料 选取2014年9月～2017年9月因男方无精症在九江市妇幼保健院辅助生殖科接受使用冻融睾丸精子行ICSI不孕症患者为研究对象。
其中，应用卵子激活技术的冻融睾丸精子19个周期（卵子激活组），未应用卵子激活技术的冻融睾丸精子23个周期（对照组）。
1.2 方法 1.2.1 睾丸精子的获得和冷冻与复苏 诊断性睾丸活检，患者于局麻下行TESE术，绷紧阴囊皮肤，在睾丸中部，用输精管分离尖钳垂直阴囊皮肤穿刺，当有明显突破感时稍微张开钳子，夹取少量睾丸组织并放入培养液中，于显微镜直视下将睾丸组织撕碎，并观察有无活动精子。
睾丸组织的冷冻：按体积比1∶1加入精子冷冻保护剂（美国Quinn’s产品），冷冻管内静置5 min，待睾丸组织与保护剂充分混匀，液氮中悬吊15 min后投入液氮冷冻保存。
冷冻睾丸组织的复苏：女方取卵当日，从液氮中取出冷冻管迅速投入37℃水浴10 min，融解后先用1 mL注射器分开曲细精管，清洗2遍，尽量多地去除红细胞，然后用两只折弯角度为90°的1 mL注射器针头将精子从曲细精管中挤出至0.5 mL培养液中，取出反复挤压过的曲细精管，置于37℃、6%二氧化碳培养箱中培养2～3 h，若有活动精子，挑选活动精子行ICSI，若无活动精子，则选择尾部弯曲柔软精子行ICSI。
1.2.2 促排卵、取卵、受精及胚胎移植 控制性刺激排卵方案采取短效长方案，降调超过14 d时对女方激素水平、窦状卵泡直径及子宫内膜厚度进行测定，达到降调标准后应用促性腺激素100～250 U启动控制下卵巢刺激周期，并对患者血清雌二醇和促黄体生成素水平及卵泡情况进行检测，根据检测结果合理调整促卵泡激素用量。
当直径达到18 mm的主导卵泡超过3个时肌内注射5000～10 000 U人绒毛膜促性腺激素，36 h后经B超引导取出卵细胞。
取出卵冠丘复合物立即放入培养液，HCG 38～40 h后选取MⅡ卵子行ICSI。
第3天选择1～3个Ⅱ级胚胎进行移植。
1.2.3 卵子激活 对于卵子激活组，ICSI后，立即将卵子移入含有10 μM钙离子载体A23187（Sigma），20 min后用培养液充分洗涤后转移到37°C 和 6% CO2培养液中继续培养。
1.3 观察指标 两组的卵子数，MⅡ（成熟卵）率、受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎数、优质胚胎数等被纳入观察指标。
1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；计数资料以[n（%）]或（n/n）表示，采用χ2检验，P0.05），具有可比性。
见表1。
2.2两组受精和胚胎发育情况 两组治疗受精、正常受精（2PN）、胚胎发育、妊娠结局：两组的MⅡ（成熟卵）率无显著性差异；受精率、正常受精率（2PN）、平均可利用胚胎数、优质胚胎数具有显著性差异（P0.05）。
见表2。
3 讨论 ICSI是将单个精子直接注入卵子胞质内激活卵子完成受精和胚胎发育，对男性不育患者，如梗阻性无精症、重度少弱畸精子症等，和常规的体外受精胚胎移植可以达到相同的临床结局[6]。
ICSI不仅能使用射出精子，还能采用附睾、睾丸中的精子并且均能使卵子完成受精和胚胎发育，取得和常规体外受精胚胎移植一样的临床结局[7]。
由于睾丸活检手术对男性的生理和心理均造成一定创伤，并且由于对曲细精管穿刺部位的差异，很可能导致取卵当日穿刺取精的失败[8]。
因此，在行诊断性睾丸活检时发现有活动精子时进行微量的睾丸精子冷冻，之后在取卵当日使用冻融睾丸精子行ICSI。
和射出精液中的精子相比，睾丸精子成熟度和活动能力有一定程度的下降。
睾丸精子经过冷冻复苏，活动能力和受精能力进一步的下降，推测是由于精子激活卵子的能力下降引起。
卵子的受精机制迄今尚未完全阐明，受精是精子和卵子之间相互作用的多步骤、多分子参与的复杂过程。
一般认为，其至少包括精子获能、顶体反应、精子穿过卵子透明带、精子和卵子质膜融合、卵子皮质反应、卵子激活、雌雄原核形成等过程。
精子进入到卵子后，释放精子起源的可溶性卵子激活因子（SOAF）诱发卵子细胞内钙离子有规律的波动称为钙震荡，钙离子浓度的改变导致相关的离子通道开放，从而激活卵子[9，10]。
最近许多证据表面，位于精子头部的PLC§可能是这种卵子激活因子[11]。
ICSI受精方式绕过了精子获能、顶体反应、穿过透明带等步骤，直接把制动后精子注入卵子胞浆内。
制动精子时通过注射针的机械应力划破精子尾部质膜，有利于释放精子中的卵子激活因子，因此与常规的体外受精方式受精失败达到10%左右相比，ICSI的受精方式更加有保障。
尽管如此，ICSI仍有1%～2%患者面临受精失败的风险[12]。
研究显示，ICSI受精失败多是由于精子缺乏卵子激活因子引起[13，14]。
因此，采用人工卵子激活的方法模拟自然状态下精子释放卵子激活因子引发钙离子震荡可以挽救ICSI受精失败[5]，人工激活的方法包括物理和化学方法，如使用离子霉素、钙离子载体A23187[15，16]。
为改善冻融精子行ICSI受精率和胚胎发育，本研究中采用钙离子载体A23187进行卵子激活。
卵子激活后明?@提高了卵子的2PN受精率，更多的优质胚胎和可利用胚胎（P参考文献] [1] Palermo G，Joris H，Devroey P，et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte[J].Lancet，1992，340（8810）：17—18. [2] Zhang Z，Zhu J，Zhang H，et al. Live birth after transfer of vitrified—warmed embryo derived from vitrified—warmed oocyte and frozen—thawed sperm following failed ICSI：Case report[J]. Rev Med Chil，2017，145（3）：402—405. [3] Aydinuraz B，Dirican EK，Olgan S，et al. Artificial oocyte activation after intracytoplasmic morphologically selected sperm injection：A prospective randomized sibling oocyte study[J].Hum Fertil（Camb），2016，19（4）：282—288. [4] Sfontouris IA，Nastri CO，Lima ML，et al.Artificial oocyte activation to improve reproductive outcomes in women with previous fertilization failure：A systematic review and Meta—analysis of RCTs[J].Hum Reprod，2015，30（8）：1831—1841. [5] Murugesu S，Saso S，Jones BP，et al. Does the use of calcium ionophore during artificial oocyte activation demonstrate an effect on pregnancy rate：A meta—analysis[J].Fertil Steril，2017，108（3）：468—482. [6] Amsiejiene A，Drasutiene G，Usoniene A，et al. The influence of age，body mass index，waist—to—hip ratio and anti—Mullerian hormone level on clinical pregnancy rates in ART[J].Gynecol Endocrinol，2017，33（1）：41—43. [7] Obruca A，Mock K，Feichtinger W，et al.，Fertilization and pregnancies following intracytoplasmic injection of testicular spermatozoa[J].J Assist Reprod Genet，1995，12（9）：627—631. [8] Guo TH，Tong XH，Luo LH，et al. Value of microsurgical varicocelectomy for severe oligo—asthenospermia patients failed in fertilization assisted by in vitro fertilization[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（9）：1669—1674. [9] Yamaguchi T，Ito M，Kuroda K，et al. The establishment of appropriate methods for egg—activation by human PLCZ1 RNA injection into human oocyte[J].Cell Calcium，2017， 65（7）：22—30. [10] Tavalaee MA，Kiani—Esfahani MH，Nasr—Esfahani. Relationship between potential sperm factors involved in oocyte activation and sperm DNA fragmentation with intra—cytoplasmic sperm injection clinical outcomes[J].Cell J，2017，18（4）：588—596. [11] Kashir J，Heindryckx B，Jones C，et al.Oocyte activation，phospholipase C zeta and human infertility[J].Hum Reprod Update，2010，16（6）：690—703. [12] Check JH，Summers—Chase D，Cohen R，et al.Artificial oocyte activation with calcium ionophore allowed fertilization and pregnancy in a couple with long—term unexplained infertility where the female partner had diminished EGG reserve and failure to fertilize oocytes despite intracytoplasmic sperm injection[J]. Clin Exp Obstet Gynecol，2010，37（4）：263—265. [13] Yanagida K，Morozumi K，Katayose H，et al. Successful pregnancy after ICSI with strontium oocyte activation in low rates of fertilization[J].Reprod Biomed Online，2006， 13（6）：801—806. [14] Nakai M，Ito J，Suzuki SI，et al. Lack of calcium oscillation causes failure of oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection in pigs[J].J Reprod Dev，2016， 62（6）：615—621. [15] Cheng D，Li J，Guo CC，et al.Failed fertilization after ICSI：Causes and countermeasures[J].Zhonghua Nan Ke Xue，2011，17（12）：1131—1134. [16] Ravel C，Kazdar N，Drapier H，et al.Assisted oocyte activation：A new tool for severe male factor infertility treatment[J].Med Sci（Paris），2016，32（2）：198—203. （收稿日期：2017—11—12）。