Snail／GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

作者：张儒英，云昆仑，乔惠珍，王冰晶，张志谦。

【关键词】 Snail；融合蛋白；多克隆抗体。

0 引言。

上皮型钙粘附素（Ecadherin，Ecad）介导的粘附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤［1］。而锌指转录因子Snail，具有下调Ecad的作用［2］，本研究通过制备Snail抗体，为进一步开展Ecad的功能研究和应用奠定了基础。

1 材料和方法。

1.1 主要试剂和菌株 主要试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。

1.2 pGEX4T1 /Snail原核表达载体的克隆。

从人血管内皮细胞提取总RNA，在逆转录酶作用下，合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，用上游引物5′CTGCAGGACTCTAATCCAG3′（含有EcoR I内切酶位点）和下游引物5′ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3′（含有Sal I内切酶位点），进行PCR扩增，得到Snail C末端377bp的DNA片断；酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法（自制）纯化回收，与pGEX4T1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌，提取质粒并酶切鉴定重组体。

1.3 融合蛋白的诱导表达与纯化。

1.3.1 表达鉴定 表达质粒Snail/ pGEX4T1转化大肠杆菌DH5α后，经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3ml LB/Amp+试管中培养3～5h。SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。

1.3.2 可溶性鉴定 离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬（50μlPBS/1ml菌液），加细菌裂解液混匀，冰浴。加入Triton X100至终浓度为1%，冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE，证实融合蛋白以包涵体形式存在。

1.3.3 纯化 加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超声30s，离心弃上清。重复3～4次。沉淀加等体积SDSPAGE loading buffer，超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6～7h。用冷0.1MKCl浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1h，然后反转电极向相反方向洗脱3～5min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDSPAGE定量，即获得纯化的融合蛋白。

1.4 抗Snail多克隆抗体的制备 抗原为原核表达并经SDSPAGE胶纯化的GST/Snail融合蛋白，免疫新西兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价，当效价达到10—5时，放血，收集血清。

1.5 抗体效价和特异性免疫学鉴定。

1.5.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体滴度：观察结果并用ELISA Reader测OD490nm。

1.5.2 Western Blot鉴定抗体 SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。