新基因FLJ39061在淋巴瘤中的表达及其功能分析
作者：严玲玲，朱涛，白向阳，卢运萍，周剑锋，马丁。
【摘要】 目的 研究淋巴瘤与反应性增生淋巴结的基因表达差异,并对淋巴瘤高表达基因FLJ39061进行初步分析。方法 将淋巴瘤淋巴结标本和反应性增生淋巴结标本液氮速冻切片，使用激光显微切割技术分离淋巴细胞，提取淋巴细胞中的mRNA与表达谱芯片杂交，通过信号扫描、处理后获得两者的表达差异基因。用生物信息学方法对一条有显著性差异的新基因FLJ39061进行初步分析。结果 表达谱芯片发现了152条差异表达基因。对淋巴瘤相关基因FLJ39061的性质进行了有效的预测，基本明确了该基因编码蛋白为一核蛋白，很可能是人MAP激酶激活的蛋白激酶2的前体或异构体。结论 FLJ39061可能作为激酶磷酸化底物调节细胞代谢，与淋巴瘤发生有关，可作为治疗靶点做进一步的功能研究。
【关键词】 淋巴瘤；表达谱芯片；FLJ39061；生物信息学；MAPK Expression of a Novel Gene FLJ39061 in Lymphoma and Its Function Analysis。
Abstract：Objective To explore the differential expressed genes in lymphoma and reactive lymph node and performed an initial analysis on a novel gene. Hypethetical Protein FIJ39061，which is highly expressed in lymphnode of lymphoma. Methods The samples were collected and flash frozen quickly to maintain the integrity of mRNA. The mRNA of the tissue from the lymphoma and reactive lymph node are marked with biotin respectively and hybridized with expression profile microarray, and the differential expressed genes are obtained. Initial bioinformatics analysis is performed on a novel gene named FLJ39061 which have no functional researches at present. Its gene structure, genomic localization, the physical and chemical characteristics of the putative protein, subcellular localization, functional domain and so on are predicted, and the systematic evolution analysis is performed on the similar proteins among several species. Results Using expression profile microarray, 152 differential expressed genes are uncovered. Efficient bioinformatics analysis have fundamentally identified that FLJ39061 is a nuclear protein, and probably is precursor or isomer of MAP kinaseactivated protein kinase 2. Conclusion By bioinformatics analysis, FLJ39061 may involved in the phosphorylation regulation. It is anticipated that this project will advance our understanding of the molecular mechanisms in the neoplastic transformation of lymphoma and the new insights will help to identify promising molecular targets for therapeutic intervention.
Key words：Lymphoma； Expression profile microarray； FLJ39061； Bioinformatics； MAPK。
0 引言。
近年来，恶性淋巴瘤发病有渐增趋势，而其发病机制至今仍不清楚。随着基因芯片、基因表达系列分析（SAGE）、抑制性消减杂交（SSH）等高通量研究方法的发展，使得从分子调控水平上研究肿瘤相关的分子机制和调控途径成为可能。这里使用基因芯片对激光显微切割获得的淋巴瘤淋巴结样本的基因表达谱进行分析，发现一个在T细胞淋巴瘤淋巴结中高表达的基因FLJ39061，并对它进行初步的生物信息学分析研究，基本明确了这个基因的生物功能与意义，为今后进一步的分子生物学实验提供了信息和方法指导。
1 材料与方法。
1.1 材料。
6例淋巴瘤淋巴结标本和反应性增生淋巴结标本来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院2005年9月～2005年12月血液科患者的手术标本，其中3名术后病理结果证实为淋巴瘤（2名为B细胞淋巴瘤，1名为T细胞淋巴瘤），另3名淋巴结肿大患者病理鉴定为反应性增生。微量mRNA提取试剂购自Qiagen公司。表达谱芯片采用Affymetrix生物芯片公司提供的人类基因组U133 plus2.0芯片。该芯片涵盖了大约54 000个人类基因序列。
1.2 方法。
1.2.1 总RNA的提取及纯化。
新鲜淋巴结组织标本取材后无菌保存于冰冷的固定液中送回实验室。将组织冰冻切片，激光显微捕获淋巴瘤细胞，微量法提取细胞中的总RNA。
1.2.2 微量RNA的体外扩增。
使用T7OligodT做逆转录反应，合成的双链cDNA用T7 RNA聚合酶做体外转录。mRNA进行无偏线性扩增以后，用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测所获aRNA的纯度和浓度。
对扩增后的aRNA进行质量鉴定，以biotin掺入进行逆转录，标记aRNA。然后进行芯片杂交。
基因芯片上的每一个基因或EST由1120对25碱基的探针组成。测得的杂交信号数据扣除背景值以后，使用Wilcoxon符号秩检验探针杂交信号强度与相应对照错配基因探针的差异。以0.05作为显著性差异标准。P≤0.05的基因作为阳性基因。6次检测结果综合比较后返回淋巴瘤和反应性增生淋巴结表达差异序列的相关信息。
1.2.5 生物信息学分析。
序列的参考序列及基本注释来源于NCBI的GenBank数据库，用map viewer观看基因组定位及基因结构。利用Spidey工具（将mRNA序列对齐到相应的基因组序列以验证基因结构。Expasy站点（的ProtParam工具预测蛋白质的理化性质，ProtScale工具预测亲水性轮廓。InterProScan [2]（预测蛋白质功能域与结构域。PSORT II（预测亚细胞定位信息。SignalP3.0服务器（预测可能的信号肽剪切位点 [3]。TMHMM服务器（预测跨膜信息。Motif Scan（搜寻已知功能基序。ELM [4]（预测蛋白质功能性位点。查询NCBI的UniGene（了解蛋白质组织表达丰度和不同发育阶段表达丰度。利用BlastP工具查询NCBI的非冗余蛋白质数据库以了解其他物种中是否有相似的蛋白质存在。ClustalX软件进行蛋白质多序列比对，并构建进化树。采用Bootstrap法产生随机种子自检验1 000次以验证进化树的可靠性。TreeView软件观察进化树结构。
2 结果。
2.1 组织完整性鉴定与RNA提取结果。
组织冰冻切片后HE染色，激光显微捕获淋巴结中的淋巴细胞。微量法提取RNA,体外扩增后RNA完整性检测结果表明18S、28S RNA条带清晰，比例适当，RNA完整性良好。
根据芯片公司提供的表达谱芯片的结果，为了保证足够的特异性，对差异基因的选取标准为：以0.05为差异显著性判断标准，连续3次淋巴瘤中表现为阳性，而在反应性增生中连续3次表现为阴性的基因做为备选基因。根据该筛选标准，淋巴瘤中表达上调的核苷酸序列有80条，从属于已知基因有13条，无相关已知基因的序列有67条；表达下调的核苷酸序列有72条，从属于已知基因的序列有26条，无相关已知基因的序列有46条。这些基因中最有可能有生物学研究意义的基因有15条。其中Hypothetical Protein FLJ39061是一个新蛋白，至今还没有相关文献的研究报道。所以对FLJ39061的核苷酸序列进行了进一步的生物信息学分析。