探析胶体金免疫层析法快速检测李痘病毒的研究
PPV最先于1915年在保加利亚发现，然后1936年在南斯拉夫，1941年罗马尼亚发现，大约30年后PPV在大多数欧洲国家都发现，包括：阿尔巴尼亚、澳大利亚、保加利亚、塞浦路斯、前捷克斯洛伐克、埃及、法国、德国、希腊、匈牙利、意大利卢森堡、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙、叙利亚、土耳其、英国、前苏联、前南斯拉夫。基于这种分布，PPV是典型的欧洲大陆的病毒，特别是中部和南部地区。根据该病毒的侵染症状，新西兰的杏树上也发现这种病毒。随着植物材料的世界性分布，美国也面临着PPV侵染的危险。
摘 要：用RT—PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白(CP)基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a—PPV重组载体，然后将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)， 经过IPTG诱导PPV CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。回收表达蛋白后免疫家兔，获得PPV特异性抗血清，经过酶联免疫吸附法测定其效价达到3.2104，然后采用该抗血清制备出专门检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，测试结果表明，该试纸条不仅特异性强、稳定性好，灵敏度也高，可以检测到1?滋g/mL粗提病毒和稀释100倍的病汁液，操作简便，10分钟之内即可出检测结果，特别适宜口岸检疫和田间快速诊断。
李痘病毒(Plum pox virus，PPV)为核果类果树危险性最大的病毒之一，是我国的进出境检疫性病毒，别名有莎卡(Sharka)病毒、李树病毒7(Prunus virus 7)、李树痘病毒(Sarka virus)等，属马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，其主要自然寄主是李属的木本植物，如杏(Prunus armeniaca L.)、桃(P. persica L.)和欧洲李(P.domestica L.)、日本李(P.salicina Lindl.)以及甜樱桃(P. avium L.)和酸樱桃(P. cerasus L.)等，传播介体为蚜虫作非持久性传播，长距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运[1]。
目前对该病毒的检测方法主要采用分子生物学检测方法[2，3]，但是此类检测方法虽然灵敏但操作步骤比较繁琐、速度慢、通量低，不适合口岸现场的大批量样品的快检快放的通关要求。而胶体金免疫检测试纸条检测方法目前已经广泛使用于生物检测的众多领域，是一种行之有效的现场快速筛查检测方法，本课题就是根据免疫学的理论和前人研究的结果，对检测李痘病毒的胶体金免疫层析试纸条进行了初步的探索研制，以便满足我国一线口岸对该病毒快速检测的需求。
一、研究材料。
李痘病毒材料由国家植物病毒检疫重点实验室(中山)提供，于—80 ℃超低温冰箱中保存备用。柠檬酸三钠、硝酸纤维素膜(NC膜)、氯金酸及各类生物酶类等均购自广州普博生物技术公司;羊抗兔抗体、碱性磷酸酶标记抗体购自军事医学科学院， 抗体纯化柱和Ni—NTA购自Invitrogen公司;原核表达载体和大肠杆菌菌株DH5和BL21(DE3)以及BIOTEK酶联检测仪、日本梯度PCR仪、三维喷点平台(XYZ3050)、微定量喷头(BJQ3000XY)、以及切展机(6008—A007)等设备均由本重点[1]实验室提供。
二、研究方法。
2.1 病毒样品的鉴定及保存。
病毒种类的确证：主要采用血清学(ELISA)结合分子生物学检测方法进行确证。
毒种保存：主要采用二种方法：一是将感病植物叶片保存于—80℃冰箱中;二是将提纯的病毒冷藏于—80℃冰箱中。
2.3 李痘病毒总核酸的提取。
采用Trizol试剂提取该病毒的总RNA，并将提取的总，RNA在—80℃下储存备用。
2.4 目的基因的RT—PCR 扩增。
根据李痘病毒外壳蛋白基因的保守序列，上游引物为PPV—F1：5'—CA GGATCC GCTGACGAAAGAGAAGAC—3，下游引物为PPV—R1：5'— TG AAGCTT CACTCCCCTCACACCGAG—3，由大连宝生物公司合成。
(2)RT—PCR条件。
直接采用一步法试剂盒PrimeScriptTM One—Step Ver.2.0(大连宝生物公司试剂盒产品)进行RT—PCR扩增，之后取5L扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检查RT—PCR结果。
RT—PCR反应条件：先50℃ 30min进行反转录，然后94℃ 3min变性，之后再94℃ 1min、58℃ 30s、72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸10min。
(1)PCR产物的回收：参照试剂盒说明进行。
(2)重组质粒的构建：采用pGEM—T载体进行TA克隆，构建重组质粒。
(3)感受态细胞制备：感受态大肠杆菌的制备参考Sambrook等(1989)的氯化钙法。
(4)重组质粒的转化及筛选：参考Sambrook等(1989)的氯化钙法。
(5)重组质粒的鉴定：主要采用酶切、PCR和测定序列三种方法结合起来进行确定。
参照pGEM—T克隆试剂盒方法进行。用酶切和PCR方法鉴定出阳性质粒后，再对其DNA序列进行测定，以确证蛋白编码基因的阅读框架是否完全正确。
采用IPTG方法诱导基因的表达并对表达产物进行SDS—PAGE分析。
2.8 表达产物的纯化。
参考INVITROGEN公司提供的蛋白质纯化方法进行纯化，并将收集到的表达蛋白进行透析，然后测定回收的表达蛋白的纯度及含量。
将纯化的CP蛋白免疫家兔，制备的抗血清加入0.02%的叠氮化钠，—20C保存。
2.10 抗体的特异性和效价的测定。
将制备的抗体用生理盐水进行梯度稀释后，采用间接ELISA方法测定。
在0.6mL1%氯金酸中加入30mL超纯水，煮沸，再快速加入0.9 mL的1%柠檬酸钠，100℃ 3—5min，然后冷却，用碳酸钾(0.2M)调节溶液的pH到7.2—7.5，0.22m过滤灭菌备用。
将李痘病毒的抗体1mL，与50mL胶体金溶液在室温下混合1小时，然后加入2mL10%的BSA，继续搅拌5min。再加入1mL10%的聚乙二醇PEG(MW2000)，再搅拌5min，12000—15000rpm离心50min，溶沉淀于5mL保存液中，0.45m过滤灭菌。
(3)制备硝酸纤维素膜。
先用3mL稀释液与3mL抗体胶体金结合物混匀，然后把硝酸纤维素膜在盖混合溶液中泡10min后取出放置于37℃温箱中烤干。
将李痘病毒抗体和羊抗兔抗体用固相溶液分别稀释到3mg/mL和1mg/mL。取李痘病毒抗体1L，点于NC膜上，放于封闭液中37℃水浴1h，再用洗涤液洗2次，风干后4℃放置备用。
(5)组装NC膜试纸条。
分别将附抗体固相NC膜侧粘在双面胶白色塑料板25mm端内，在其中间粘附金标抗体结合物NC膜条带，再在其上粘1条宽25mm的NC膜与抗体固相NC膜重叠2mm，再粘1层黄胶带。在50mm端粘1宽32mm的吸水纸与抗体固相NC膜重叠2mm，最后将重叠粘合在一起的NC膜和胶带裁切成宽5mm的条带即可。
2.12 试纸条的测试。
(1)制样：取0.1g样品加入PBST缓冲液(pH7.4)1mL研磨(1：10)。
(2)取样：低速离心后取300～400L的上清放入0.5mL离心管中。
(3)测试：将试纸条插入检测样品液的上清中，10min左右判断结果。
(4)判断结论：如果质控点出现红色条带而测试点没有条带， 说。
明未检测到病毒，结论为阴性;如果检测点和质控点都出现了红色条带，说明检测到了病毒，结论为阳性;;如果检测点和质控点都没有出现红色条带，则测试无效。
三、结果与分析。
提取感染李痘病毒植物叶片的总核酸，用其外壳蛋白基因特异性引物进行RT—PCR扩增，再将扩增产物克隆到pGEM—T载体上，序列测定结果表明李痘病毒996bp的外壳蛋白基因序列，与GenBank 报道的外壳蛋白基因序列(NC_001445)完全一致。
经过酶切、PCR扩增及序列分析确证该重组的原核表达阅读框架完全正确。
将原核表达的重组载体pET29a—PPV CP转化大肠杆菌的专用表达菌株及BL21(DE3)菌株中，经过IPTG诱导下进行外源蛋白基因的表达，表达产物经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明：有一预期的39kDa的特异性蛋白等到了表达，对表达产物进行了纯化后制备抗血清。
3.4 制备抗血清。
将回收的外壳蛋白基因表达的产物免疫大白兔后，最后获得了50mL的抗血清，经过间接ELISA测定其效价为3.2104，而且该抗血清与健康的桃树、李树和樱桃叶片等李属植物及PNRSV病毒都无血清学反应。
3.5.1 特异性测试。
通过对TMV、CMV、PVY、PNRSV等病毒等的测定，结果显示都为阴性，无交叉反应;而用PPV测试时，健康对照和阴性对照仅质控点出现红色条带，结果为阴性，而测试点和质控点都出现红色条带，结果为阳性。(图1)。
1.烟草花叶病毒;2—5.不同稀释度的PPV感病汁液;6.黄瓜花叶病毒;7.李坏死环斑病毒;8.马铃薯Y病毒。
3.5.2 灵敏度检测。
酶联检测粗提纯的PPV灵敏度为100ng/mL，检测病汁液可稀释1000倍;试纸条检测粗提纯的PPV灵敏度为1000ng/mL，检测病汁液可稀释100倍(表1)。试纸条检测灵敏度没有酶联高，检测灵敏度低于ELISA一个数量级，但基本可满足常规初筛定性检测的需要。
3.5.3 稳定性测试。
试纸条在4℃冰箱干燥密封保存一个月后重新测试，结果同前。
四、结束语。
目前虽然ELISA仍然是植物病毒检测的一个比较通行的常规方法，但它需要专用仪器、设备、专业人员以及诸多试剂药品，所需时间长，操作较为烦琐，有一定的技术要求，普及到基层口岸比较难。为了更快更好更便利的在口岸实施进出境植物种子、苗木、花卉等病毒的检测，需要有一个更直观更方便更快的检测方法。
胶体金免疫层析试纸检测正是一个非常适合口岸病毒检测的方法，此技术操作简单、快速、特异性强，特别适于口岸检疫和大田现场快速检测。它不但灵敏度比较高，而且非常快速，一般只需要10分钟既可以判断检测结果。国外已有人开展这方面的研究工作，国内也有类似的研究[4]。本项目研制的试纸条能对新鲜的或冻干的感染李痘病毒的植物叶片材料进行检测，可满足口岸现场对该病毒的常规筛查检测之用， 操作简单迅速，是一种特别适合在口岸基层实验室和现场应用的植物病毒快速检测方法。
参考文献：
[1]L.Levy. First Report of Plum pox virus in Prunus persica in the United States. Plant Dis，2000，84：202.
[2]陈定虎，杨雷亮，王章根，等.李痘病毒及其两个主要流行株系的分子鉴定[J].植物检疫，2008(1)：15—17.
[3]陈定虎，周灼标，郑雷青，等.用二重PCR方法检测李痘病毒和李坏死环斑病毒[J].植物保护，2006(4)：107—109.
[4]魏梅生，杨翠云，李桂芬，等.番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制[J].植物检疫，2008(2)：75—77.