大鼠胰岛细胞分离_参芪复方对ＧＫ大鼠胰岛β细胞凋亡及Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响
摘要 目的：观察参芪复方对自发性2型糖尿病动物GK大鼠（Goto—Kakizaki wister rats）胰岛β细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。
方法：选取4月龄SPF级雄性GK大鼠50只，随机分为模型组，盐酸二甲双胍组，参芪复方低、高剂量组，并另设正常Wister大鼠对照组。
连续灌药4周后，TUNEL染色观察各组胰岛β细胞凋亡指数（AI），并采用免疫组化染色，Mias—2000图像分析系统观察各组大鼠胰岛β细胞Caspase—3阳性物质积分光密度。
结果：模型及低剂量组β细胞AI较正常组显著增高（P0．05）；模型组及低剂量组胰岛Caspase—3积分光密度显著高于正常组（P0．05）。
结论：参芪复方能够抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，机制可能与其抑制β细胞Caspase—3表达有关。
关键词 参芪复方 GK大鼠 胰岛β细胞凋亡 Caspase—3 参芪复方主要由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成，具有益气养阴、清热生津、活血化瘀的功效，在临床使用取得了较好的疗效。
以往研究提示，参芪复方具有抗2型糖尿病早期动脉粥样硬化、低度炎症的作用[1—2]，但其对胰岛β细胞凋亡的影响未见报道。
本研究观察了其对自发性2型糖尿病动物GK大鼠胰岛β细胞凋亡的影响并对其可能作用机制进行了初步探讨。
1 材料 1．1 动物：4月龄雄性SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠10只（中国科学院上海实验动物中心提供），按2~3只/笼饲养于独立通气笼具（IVC）系统内。
1．2 主要药品与试剂：参芪复方浸膏粉（1g浸膏粉相当于原生药10g，四川大学华西药学院药厂提供，批号20031008），盐酸二甲双胍片（天津太平洋制药有限公司，批号：20040523），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（博士德公司），Caspase—3一抗、即用型SABC试剂盒（博士德公司）。
1．3 主要仪器：Mias—2000图象分析系统（四川大学智胜软件股份有限公司），OLYMPUS BX50型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）等。
2 方法 2．1 分组方法：GK大鼠适应性饲养1周后，尾静脉取血测随机血糖，随机血糖≤11．1mmol/L者剔除，共有6只[3]。
余44只按血糖由高到低排列编号，依据随机排列表分为模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药高剂量组，另设普通Wister大鼠正常对照组，每组11只。
各组均喂饲普通饲料。
2．2 给药方法：正常对照组和模型组予生理盐水5ml/kg・d灌服；二甲双胍组予盐酸二甲双胍125．0mg/kg・d，中药低剂量、高剂量两组分别予参芪复方0．5g/kg・d、2．0g/kg・d，共28天。
2．3 观察指标及检测方法：有两项。
2．3．1 β细胞凋亡计数：大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，应用TUNEL法染凋亡细胞，试剂盒购于博士德公司，操作按试剂盒说明进行。
每例切片计数10个400倍视野的凋亡细胞数，然后按公式计算细胞凋亡指数（AI）。
2．3．2 胰岛Caspase—3表达：大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，用FFA液（甲醛醋酸酒精固定液）固定，石蜡包埋，滚动式切片机纵切成4μm薄片，将切片置于经防脱片剂处理后的载玻片上，使切片紧密粘附，常规脱蜡至水，余参照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书染色。
用OLYMPUS BX50光学显微镜观察染色结果，胞浆棕染为阳性，每张切片选3个胰岛，输入Mias—2000图像分析系统，在200倍镜下分别测量胰岛细胞Caspase—3阳性物质积分光密度并计算其均值。
2．4 统计方法：用SPSS13．0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析。
方差齐采用LSD，方差不齐采用Tamhanecs’T2统计方法。
3 结果 3．1 一般状况：实验过程中模型组3只大鼠、低剂量组和二甲双胍组各1只大鼠死亡。
3．2 参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数的影响：具体见表1。
模型组及低剂量组较正常组凋亡指数显著增高（P0．05)；各治疗组凋亡指数较模型组显著降低（P0．05）；高剂量组及二甲双胍组Caspase—3积分光密度较模型组显著下降（P0．05）；高剂量组和二甲双胍组积分光密度较低剂量组显著降低（P[4]。
细胞凋亡(apoptosis)，是由局部环境生理或病理性变化引起的、自身内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细胞自发性死亡方式。
染色质浓集、胞膜皱缩和凋亡小体的形成为其形态学特点，核酸内切酶活化，使染色质在核小体间断裂，从而在DNA电泳时形成特征性的梯形带为其生化特征。
它常涉及一系列的基因激活表达及调控，是生物界重要的生命现象之一。
过去认为胰岛素抵抗在2型糖尿病病理生理机制中占主要位置，但Butler等[5]研究表明，无论是肥胖还是非肥胖的2型糖尿病患者，与其体重指数相当的非糖尿病人群相比，其胰岛β细胞数目明显减少，胰岛β细胞凋亡发生率也明显高于正常人群，而两组人群间胰岛再生和分化过程并无明显区别。
这个结果高度提示胰岛β细胞凋亡数目减少在2型糖尿病患者胰岛功能衰竭中发挥了举足轻重的作用。
因此，延缓和（或）防止胰岛β细胞凋亡已成为糖尿病治疗的一个重要方向。
本研究证实参芪复方能显著抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，提示降糖作用不及西药的中药复方可能通过干预胰岛β细胞凋亡这一重要环节治疗2型糖尿病。
目前研究认为，半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族是细胞凋亡过程的中心成分。
外界信号分子通过线粒体途径或死亡受体途经激活Caspasae家族导致凋亡的发生，两条途经的关键环节是Caspase—3的活化[6]。
活化的Caspase—3通过进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞发生凋亡。
因此，Caspase—3是反映凋亡的一个很好指标[7]，处于凋亡发生的关键环节，检测Caspase—3可较其它方法更能检测凋亡的早期事件[8]。
本研究证实，参芪复方可显著减少GK大鼠胰岛β细胞凋亡蛋白酶Caspase—3的表达，以高剂量组作用明显。
因此，我们认为减少胰岛β细胞Caspase—3表达可能为参芪复方抗胰岛β细胞凋亡的机制之一。
总之，本研究初步证实参芪复方可明显改善GK大鼠胰岛β细胞凋亡，保护胰岛β细胞，其机制可能与抑制胰岛β细胞Caspase—3表达有关。
5 参考文献 ［1］张红敏,陈世伟,谢春光，等.参芪复方抗自发性糖尿病GK大鼠早期动脉粥样硬化的作用机制［J］.中国中药杂志2006，31(15):1272—1275. ［2］张红敏,陈世伟,谢春光,等.参芪复方对大鼠炎症标志物的影响及机理探讨［J］.中药材，2006，29(3):249—252. ［3］黄松.糖尿病动物模型研究现状及进展［J］.广西医学，2002，24(1):46—48. �［4］Picarel�—Blanchot F, Berthelier C, Builbe D, et al. Imparied insulin secretion and excessive hepativ glucose production are both early events in the diabetic GK rat［J］. Am J Physio1, 1996, 271(4pt1):E755. �［5］Butler� AB，Janson J, Bonner Weir S et al. Beta—cell deficit and in—creased beta cell apoptosis in humans with type 2 diabetes［J］ .Diabetes, 2003, 52(1):102—110. �［6］Green� DR. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors［J］. Cell，2000,102(1):1—4. ［7］张勇,沈佰华,马安伦.用荧光定量法检测Caspase—3的活性［J］.细胞与分子免疫学杂志，2001，17(2):188—190. ［8］彭黎明,江虹.细胞凋亡检测方法的研究进展［J］.中华病理学杂志，2001，20(2):135—136. 收稿日期 2007—06—07 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
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