泌尿系结石的基因诊断和治疗
泌尿系结石是泌尿系统最常见的疾病之一，在我国一般人群中发病率高达1%—10%[1]。其中约25%的患者需住院治疗，在泌尿外科住院患者中占居首位。近年来，我国泌尿系结石的发病率有增加趋势，是世界上三大结石高发区之一。
随着体外冲击波碎石术(extracorporeal shock wave lithotripsy, ESWL)、经皮肾镜取石术(percutaneous nephrolithotripsy, PNL)、输尿管肾镜取石术(ureterorenoscope lithotripsy, URL)、腹腔镜取石术(laparoscope lithotomy)等一系列新技术的陆续出现，泌尿系结石的治疗逐渐走向微创化并日臻成熟。而枸橼酸盐、α受体阻滞剂等多种溶石、排石药物的出现也使排石治疗有了长足进步。然而，泌尿系结石的复发率仍然居高不下，结石的反复复发常可引起肾功能损害，同时，泌尿系结石的发病率仍有继续升高的趋势。因此，针对其病因的诊断和防治逐渐成为泌尿外科工作者关注的重点。
饮食、环境和遗传为影响泌尿系结石发病的三大因素。近年来，随着现代分子生物技术的迅速发展，泌尿系结石的遗传因素越来越引起人们关注。而人类基因组计划的顺利完成和后基因组时代的飞速发展使得基因诊断和治疗成为可能。目前已发现大约有30多种泌尿系结石致病基因，它们可直接或间接引起泌尿系结石的发生，而一些新的基因在不断地被发现。特别是一些单基因疾病如原发性高草酸尿症、黄嘌呤尿症等在基因诊断治疗上有着切实的可操作性。本文就泌尿系结石的基因诊断和治疗做一初步的探讨。
1.1 基因诊断的发展现状 基因诊断即DNA诊断或分子遗传学诊断，是指以DNA或RNA作为检测对象的疾病诊断方法。自1983年Mullis等[2]首次将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术运用于镰状细胞性贫血的基因分析后，基因诊断技术得到了飞速的发展，衍生出为数众多的新技术和新方法。人类基因组计划的完成使得大多数致病基因的定位成为可能，推动基因诊断技术成为遗传性疾病或遗传相关疾病的最直接、最准确的诊断手段。基因诊断经过十多年的发展，现已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等的诊断和预后判断。
1.2 基因诊断的策略 对于已经定位了基因的遗传性疾病，可以通过直接检测该基因来进行诊断。但对于基因未知的遗传性疾病或遗传相关性疾病，基因的定位诊断的策略尤为重要。致病基因的定位策略主要有以下几条：①利用蛋白组学技术搜索差异蛋白，通过对差异蛋白的质谱分析来获得致病基因或致病基因相关基因的信息，最终可将致病基因定位于基因组的某一区段；②对第一代DNA遗传标记限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、第二代DNA遗传标记微卫星多态性(microsatellite polymorphisms, SiFR)、第三代DNA遗传标记单核苷酸多态性(single nucletide polymorphisms, SNPs)进行遗传连锁分析，将致病基因定位于基因组的某一区段，最终分离出致病基因；③利用比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)系统地检测整个染色体基因组的获得和丢失，最终获得致病位点。在人类基因组中有超过300万个以上的SNPs，其密度可以达到1/1000bp，通过SNPs进行遗传连锁分析来定位致病基因是一种非常有前景的技术，现已广泛应用于遗传性疾病或遗传相关性疾病的基因的筛查和诊断。
1.3 基因诊断的技术方法 从PCR到基因芯片，基因诊断的技术方法为数众多。基因芯片(gene chip)技术是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，是由微电子学、物理学、化学、计算机科学与生命科学交叉综合的高科技技术。可高通量、高灵敏度、高特异性地分析DNA(cDNA)，有助于对疾病的发病机理的研究，寻找疾病诊断和治疗的靶分子。遗传多态性连锁分析是基于DNA遗传标记如RFLP、STR、SNPs的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析(association analysis)，可用于疾病易感基因定位，尤其是以SNPs为遗传标记的第三代DNA多态性遗传连锁分析，可对致病基因或易感基因进行精细定位。基于高通量的基因芯片和SNPs的遗传连锁分析是目前的研究热点。
1.4.1 原发性高草酸尿症Ⅰ型 原发性高草酸尿症I型(primary hyperoxaluria type 1, PH1)是一种比较罕见的常染色体隐性遗传病，每60000—120000儿童中有1例患者，其特点是肝脏丙氨酸乙醛酸转氨酶(alanine glyoxylate aminotransferase, AGT)缺陷，导致内源性草酸合成增加，血草酸、尿草酸含量明显升高，最终出现全身草酸盐沉着症、泌尿系草酸钙结石、终末期肾病。确诊常依赖于肝活检和AGT酶活性测定。此类患者目前有效的治疗方法只有肝移植或肝肾联合移植，而患者的早期诊断尤为重要。AGT定位于过氧化物酶体中，由单拷贝基因AGXT编码，AGXT定位于人2q37.3，AGXT的突变导致AGT错误定位于线粒体或无法形成二聚体等异常可能是PH1的分子基础。Milosevic等[3]利用末端标记循环测序法成功确诊了三个疑似PH1的家系，认为该方法较肝活检无创、简单，可以早期甚至产前诊断PH1，并可适用于先证者的无症状亲属的筛查。Pirulli等[4]通过变性高效液相色谱法筛查了20个PH1患者的AGXT基因，发现了AGXT基因中的13个突变位点和1个多态性位点，认为这种方便快捷的新技术可以适用于尿石症患者AGXT突变位点的筛选和健康携带者AGXT多态性位点的筛查。其他方法诸如单链构象多态性(SSCP)也有报道。AGXT上已发现超过50个突变，这些突变常可导致PH1。Rumsby[5]认为对AGXT基因上突变位点的检测可作为PH1诊断的一线检查。
1.4.2 原发性高草酸尿症Ⅱ型 原发性高草酸尿症Ⅱ型(primary hyperoxaluria type 2, PH2)也是一种常染色体隐性遗传病，较PH1更为罕见，临床症状较PH1为轻，起病稍晚。其特点是肝脏羟基丙酮酸/乙醛酸还原酶(GRHPR)缺陷，该酶由GRHPR基因编码，定位于9cen。GRHPR的缺陷导致肝脏生成的内源性草酸合成增加。确诊常依赖于肝活检和GRHPR酶活性测定。Cramer[6]和Cregeen[7]分别联合应用PCRSSCP和测序技术对4例和19例患者的GRHPR基因进行了分析，发现了11个突变位点和2个多态性位点，认为GRHPR基因的突变是导致PH2的分子机制。Webster等[8]利用STR等技术对11名患者的基因进行了连锁分析，发现GRHPR上的两个突变位点。PH2的基因诊断在目前还不能代替肝活检，但随着PH2的分子机制的阐明和突变位点的不断发现，DNA诊断有可能成为诊断PH2理想的手段。
1.4.3 特发性草酸钙结石 PH引起的遗传性草酸钙结石比较少见，临床上常见的是特发性草酸钙结石(idiopathic calcium oxalate stone)，其特点是缺乏明确的遗传背景，有一定的家族聚集现象，找不到明显的致病原因，可占草酸钙结石全部病例数的80%以上。特发性草酸钙结石病是一个复杂的、多病因的疾病，是环境和遗传因素共同作用的结果，其特征是尿高钙、高草酸、低枸橼酸和高尿酸，也有人提出尿中的葡萄糖胺、镁离子和某些蛋白质对促进或抑制结石形成有作用。Goodman等[9]利用计算机模型，通过方差分析、HardyWeinberg分析、分离分析研究了101例结石患者和101例对照的遗传模式，认为可能有3或4个主要基因参与了特发性草酸钙结石的形成。目前，对于特发性草酸钙结石的致病基因或易感基因尚不了解，有待于进一步研究。
1.4.4 胱氨酸尿症 胱氨酸尿症是一种常染色体隐性遗传病，每2000—15000新生儿中可发现1例，其特点是肾脏和肠道氨基二羧酸(如胱氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸等)转运缺陷，其中胱氨酸溶解度较低而易析出形成结石。胱氨酸尿症Ⅰ型(cystinuria, type 1)的致病基因为SLC 3A1，定位在2p21。胱氨酸尿症Ⅱ型(cystinuria, type 2)和胱氨酸尿症Ⅲ型(cystinuria, type 3)的致病基因为SLC 7A9，定位在19q13.1。Skopkova等[10]通过对24个胱氨酸尿症家系的SLC 3A1和SLC 7A9直接测序，在SLC 3A1上发现了10个突变位点，在SLC 7A9上发现了6个突变位点，认为这些突变位点的分布和频率是导致胱氨酸尿症的重要因素。Brauers等[11]对2个非Ⅰ型胱氨酸尿症家系进行基因连锁分析，发现SLC 7A5基因与非Ⅰ型胱氨酸尿症密切相关，可能是非Ⅰ型胱氨酸尿症的新的致病基因。随着胱氨酸尿症的分子机制的解析，对胱氨酸尿症相关基因的突变位点的检测将成为胱氨酸尿症基因治疗的重要基础。
近年来，其他疾病诸如特发性高钙尿症、低枸橼酸尿症等的分子机制研究也得到了长足的发展。分子遗传学的发展必将推动基因诊断在泌尿系结石中的应用。
2.1 基因治疗的研究现状 基因治疗是指将外源基因片段(DNA或RNA)导入靶细胞或组织，以纠正或补偿基因的缺陷，封闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗的目的。Anderson[12]于1984年首先全面阐述了基因治疗的一般原理。1995年，Blaese等[13]报道了世界上首例成功的基因治疗，他们运用逆转录病毒载体将正常的腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)基因导入ADASCID患儿的体内，治疗后患儿细胞及体液免疫功能及临床症状明显改善。在最近20年里，基因治疗得到了飞速的发展，成为恶性肿瘤、遗传性疾病、免疫性疾病、感染性疾病等最有前景的治疗手段。
2.2 基因治疗的策略。
2.2.1 纠正或补偿基因的缺陷 理论上纠正或补偿基因的缺陷在临床中易于实践，缺陷基因如恶性肿瘤中的抑癌基因、遗传性疾病中的大多数致病基因，只要用适当的载体将其导入就可以达到治疗的目的。
2.2.2 封闭或抑制异常基因的表达 异常基因如恶性肿瘤中的癌基因、免疫性疾病中的炎性基因等，其表达产物常在疾病的进展中起到关键的作用，封闭或抑制其表达可以达到治疗的目的。实现的手段有基因敲除(knock out)、反义寡核苷酸(ODNs)、反义RNA(antisense RNA)、核酶(ribozyme)、RNA干扰(RNA interference, RNAi)等。其中RNAi技术是近年来研究的热点。
2.2.3 RNA激活基因 一般认为小片段的非编码RNA在基因的调节中只有沉默基因的作用，即RNAi现象。但最近有学者发现小RNA在某些基因调节中也可以起到激活作用，并命名为“基因激活(dsRNAinduced gene activation, RNAa)”。Science杂志评价这一发现“将是一强有力的生物学工具并可以发展为癌症等疾病的新的治疗手段”。
2.3 基因治疗的载体 基因治疗的关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，并可以按我们预期的方式适当地表达。理想的载体必须是高效、稳定、可控的，并且具有良好的靶向性。目前基因治疗的载体尚有待进一步改造。一般载体可分为病毒载体和非病毒载体。
2.3.1 病毒载体 常见的病毒载体包括逆转录病毒载体(retrovirus, RV)、慢病毒载体(lentivirus, LV)、腺病毒载体(adenovirus, AV)、腺相关病毒载体(adenoassociated virus, AAV)等。这些病毒往往是细胞的自然感染者，在基因的导入上占据了天然的优势。病毒载体都需要进行一定程度的改造，将部分对人体毒害较大或基因转移中不需要的基因删除，留下空间插入目的基因。RV和LV可稳定整合于宿主DNA，长期表达目的基因，但整合宿主DNA有可能引起插入突变，导致宿主基因组相关基因表达异常。AV载体容量大，最高可达36kb，不整合宿主DNA，表达效率高，但AV载体免疫原性强，表达时间相对较短。AAV载体可定向整合于人19号染色体的长臂，不引起插入突变，可长期稳定表达，但容量小，最大仅4.4kb，且需要辅助病毒。各种病毒载体在基因的承载上各有优缺点，目前尚无比较完美的病毒载体。
2.3.2 非病毒载体 非病毒载体相对于病毒载体来说低毒、低免疫原性、外源基因整合概率低、无基因插入片段大小限制、使用简单、制备方便、易于生产、便于保存和检验，但目前非病毒载体表达时间短，转染效率低，仍需进一步改造。常用的非病毒载体有真核表达质粒、脂质体、阳离子聚合物、纳米颗粒等等。