万寿菊花萃取物中叶黄素的分离与纯化
作者：李高峰 聂永亮 王佩维。
【摘要】 目的从万寿菊花萃取物的皂化产物中分离、纯化制备高纯度叶黄素。方法万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取得到万寿菊花萃取物，加碱皂化的产物用水稀释后，用二氯甲烷从中萃取叶黄素，在分出的水相中加入氯化钙，分离出被分散在水相的叶黄素，蒸馏溶剂后用醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，再用无水乙醇洗涤，制得高纯度叶黄素。结果实验确定了加水量为皂化产物的4倍；二氯甲烷用量为水与皂化产物的和；醋酸乙酯与石油醚的体积比为1∶4，用量为分离产物的3倍。结论此法制得的叶黄素纯度高，色泽纯正，工艺简单。
叶黄素是天然抗氧化剂，具有良好的抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤的能力［1］,可用于防治由于机体衰老引发的冠心病、心血管硬化［2］和肿瘤等疾病。另外，叶黄素是眼中含有的仅有的两种类胡萝卜素之一，预防和治疗老年性眼球视网膜黄斑区病变［3］、白内障等眼部疾病是叶黄素的独特功能。不仅如此，叶黄素着色能力强，又富有营养，是优良的食品着色剂和动物饲料添加剂［4］,因此，叶黄素被广泛应用于医药、保健品、化妆品、食品、动物饲料、水产、烟草等行业［1］。万寿菊中的反式叶黄素酯的含量很高，而其他类胡萝卜素的含量较少，是非常好的叶黄素来源。本研究从叶黄素浸膏皂化产物中萃取分离、纯化制备高纯度叶黄素的工艺条件，以期为规模制备高纯度叶黄素提供参考。
1 材料与仪器 万寿菊干花颗粒由大同市天然色素有限公司提供；叶黄素标准样品，由万寿菊干花经超临界CO2萃取制备出浸膏，经皂化、分离和纯化处理制得,经天然产物标准样品国家核心实验室（北京）分析鉴定含量为97.29%。 HA121—50—01—C超临界萃取装置（采用一萃二分流程）由江苏南通华安超临界萃取有限公司制造；LC5500型高效液相色谱仪由北京东西电子技术研究所制造；ME211 型超声波清洗器，美国Metter Electronics 公司生产; Millipore 膜过滤器及真空泵, 美国Waters 公司生产； DF—20型流水式中药粉碎机，由无锡中银机械制造有限公司制造。CO2，由太原天计应用化工有限公司生产，食品级，纯度在99%以上；万寿菊萃取物由万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取制得；皂化、分离与纯化所用试剂均为分析纯，由天津精细化工开发中心生产；HPLC分析用试剂为分析纯，由北京化工厂生产；水为二次蒸馏水。
2 方法。
万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取，得到的萃取物在KOH的醇溶液中皂化反应后，将溶剂蒸馏得到皂化产物。
将皂化产物加水稀释后，用二氯甲烷萃取，分出水层，水洗二氯甲烷层至水相无色透明，且为中性。收集萃取与水洗过程中分出的水相，在其中加入足量氯化钙，至水相无色透明，过滤沉淀，用二氯甲烷洗涤沉淀，收集洗液，并用水洗至水相无色透明且为中性。将洗液与萃取所得的二氯甲烷相合并，蒸馏溶剂得到叶黄素粗品。
叶黄素粗品中加入醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，过滤除去杂质，得到叶黄素结晶体；再用无水乙醇洗涤，得到叶黄素的重结晶体。
2.4 叶黄素的高效液相色谱分析。
称取叶黄素样品20.0 mg，用流动相配成8×10—6 g·ml —1的溶液。色谱条件: 色谱柱为Diamonsil C18柱; 甲醇 ∶乙腈∶醋酸乙酯∶水（V∶V∶V∶V）= 30∶29∶40∶1 为流动相; 流速0.75 ml·min—1; 检测波长450 nm; 柱温25 ℃; 进样量20 μl。色谱图见图1。
3 结果。
3.1 分离过程。
加水稀释皂化产物,可以去除其中水溶性杂质,水的用量过大，会使油水界面上的脂肪酸皂浓度增大，容易形成较厚的中间层，要想得到较好的分离效果，必须加大二氯甲烷的用量；而水的用量过小，则会使体系的黏度过大，不利于分离。经实验确定：水的用量为皂化产物脱出溶剂后浓缩物量的4倍。