几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡的研究
【摘要】 本研究评价几种临床常用的抗肿瘤药物顺铂（CDDP）、羟基喜树碱(HCPT)、高三尖杉酯碱(HHT)和米托蒽醌(MIT)在白血病治疗中的作用，并分析其在诱导Jurkat细胞凋亡的作用，为白血病的临床治疗提供新的理论依据和思路。用Annexin V/PI双参数流式分析方法，检测这几种抗肿瘤药物诱导Jurkat细胞凋亡和死亡的效应。结果表明：MIT和HCPT在加药处理早期4小时 (P0.05)和后期第8小时(P0.05)都有明显的诱导Jurkat细胞凋亡的效应。HHT有明显诱导Jurkat细胞凋亡的效果，但各剂量组之间无显著差异。CDDP在高浓度和长时间作用时才显示较弱的细胞凋亡效应，明显弱于前3者。各种药物作用后均未观察到明显的细胞死亡效应。结论：MIT诱导Jurkat细胞凋亡的作用最显著，Annexin V流式分析方法可作为一种可靠的临床药物筛选的方法。
【关键词】 抗癌药物；细胞凋亡；Jurkat细胞系；Annexin V。
Effect of Several Anti—tumor Drugs on Apoptosis Induction in Jurkat Cell Line。
Abstract Cisplatin (CDDP)，homoharringtonine(HHT)，mitoxantrone(MIT) and hydroxycamptothecin(HCPT) are highly effective anti—tumor drugs. To evaluate their effects in the therapy of leukemia and establish a valuable method to estimate anti—tumor drugs，Annexin V/PI double parameter flow cytometry was used to detect the effects of these drug inducing apoptosis and death in Jurkat cell line. The results showed that MIT and HCTP—induced apoptosis effects on Jurkat cell line were obvious at 4 hours in early phase after adding drug (P0.05) and at 8 hours in late phase after adding drug (P0.05). HHT had obvious effect on inducing apoptosis of Jurkat cells，but no significant difference from low to high doses. The effect of CDDP on inducing apoptosis of Jurkat cell line was obviously weaker than that of HHT，MIT and HCPT，its weak effect on apoptosis of Jurkat cell line was found only at high concentration of drug for long time. Death effects on Jurkat cell line can not be observed in every experimental group. It is concluded that low dose of MIT can effectively induced apoptosis of Jurkat cell line. Annexin V/PI double parameter flow cytometry can be used as a reliable method for clinical screening anti—tumor drugs.
Key words anti—tumor drug; apoptosis; Jurkat cell line; Annexin V。
化疗是肿瘤治疗的一种重要方法，新的抗肿瘤药物也不断地涌现。国内在上个世纪90年代上市的抗癌药物中化学合成药米托蒽醌(MIT)、羟基脲和顺铂(CDDP)等少数几种抗癌药物，通过与DNA分子结合抑制核酸合成引起细胞死亡，这类药物称之为细胞周期非特异性药物。本研究选用米托蒽醌(MIT)、顺铂(CDDP)、羟基喜树碱(HCPT)、 高三尖杉酯碱(HHT)诱导Jurkat细胞凋亡，并通过Annexin V /PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比例，分析不同作用时间以及不同药物浓度对Jurkat细胞凋亡的影响。材料和方法。
材料。
Jurkat细胞系由本实验室保存。顺铂（CDDP）为齐鲁制药有限公司产品、羟基喜树碱（HCPT）为黄石飞云制药厂产品、 高三尖杉酯碱（HHT）为杭州民生药业公司产品、米托蒽醌（MIT）为浙江瑞新药业公司产品；RPMI 1640为Invitrgen产品；Annexin V FITC/PI试剂盒购自晶美生物公司；贝克曼流式细胞分析仪 Elite EXP。
Jurkat细胞在5% CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1×106/ml，加入24孔板，每孔1 ml细胞悬液。用无血清细胞悬液将顺铂、 羟基喜树碱、高三尖杉酯碱和米托蒽醌药物配制成1 mg/ml溶液；每组药物分别设4个浓度：12.5、25、50、100 μg/ml；分别加入24孔培养板，作3个复孔。置于5％ CO2孵箱培养。
Annexin V/PI流式双参数分析［1—3］。
分别于加入药物作用2、4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250 μl结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml；取100 μl细胞悬液，加5 μl Annexin V/FITC和10 μl (20 μg/ml)的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS洗涤2次，进行流式细胞仪（FACS）分析。Annexin V—FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。图1—5横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数，图中两个峰中的左边峰表示阴性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。
统计学分析。
各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X±SD表示，多个均数的两两比较采用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包 (第三版)PEMS 3.1软件进行检验。 结果。
CDDP各剂量组与对照组（未处理组）相比，在其剂量为12.5 μg/ml时，各个作用时间点上Jurkat细胞凋亡率均无明显变化；剂量为25 μg/ml和50 μg/ml时，在2小时和4小时Jurkat细胞凋亡率也无明显变化，而在作用8小时时Jurkat细胞凋亡率才有明显增高，分别为13.6%和23.9%，与对照组相比有显著差异（P0.05）。当CDDP药物浓度增大至100 μg/ml时，作用2小时和4小时时，Jurkat细胞凋亡率无变化，在8小时时Jurkat细胞凋亡率为19.9%，与50 μg/ml剂量相比，诱导细胞凋亡率不但没有明显差别，而且有所降低（图1），这表明CDDP的作用有药物饱和效应。
HHT各剂量组的细胞凋亡率与对照组（未处理组）相比均有明显增高（P0.05）。Jurkat细胞凋亡率与药物剂量关系不明显，但与作用时间明显成正比。12.5 μg/ml HHT作用2、4和8小时时Jurkat细胞凋亡率分别是4.9%、20.4%和35.4% (P0.05)； 25 μg/ml HHT时分别为5.5%、12.1%和27.2%；50 μg/ml HHT时分别为5.8%、12.2%和33.0%； 100 μg/ml HHT时分别是5.7%，12.1%和35.0% (P0.05)。不同药物浓度HHT在同一时间点之间诱导Jurkat细胞凋亡率没有明显差别（图2）。
与对照组（未处理组）相比，MIT各剂量组在作用2小时时Jurkat细胞凋亡率无明显不同，但随作用时间延长均有明显增高（P 0.05）。12.5 μg/ml剂量组作用2、4和8小时时Jurkat细胞凋亡率分别是4.2%、20.5%和52.4%(P0.05)，25 μg/ml组分别为4.9%、30.1%和68.9%， 50 μg/ml组分别是7.2%、37.9%和81.8%(P0.05) （图3 ），100 μg/ml组分别为6.6%，41.5%和84.1%，各作用时间点之间差别均有显著差异（P0.05）（图4）。Jurkat细胞凋亡率在药物低剂量时随剂量增大明显增高；100 μg/ml组作用效应与50 μg/ml剂量组没有明显差别，显示有剂量饱和效应。
HCPT各剂量组与对照组（未处理组）相比，Jurkat细胞凋亡率均有明显增高（P0.05），Jurkat细胞凋亡率随药物剂量增大和时间延长而明显增高，12.5 μg/ml HCPT 剂量组作用2、4和8小时时Jurkat细胞凋亡率分别是3.4%、20.9%和30.3% (P0.05)；而25 μg/ml组分别为3.7%、19.1%和30.3%；50 μg/ml组分别是5.9%、23.8%和44.6% (P0.05)，100 μg/ml组分别是3.0%、15.8%和55.7%(P0.05)。HCPT相同剂量不同作用时间点的Jurkat细胞凋亡率均有显著差异(P0.05) （图5） ；HCPT不同剂量同一作用时间点的诱导Jurkat细胞凋亡率在2小时与4小时间没有显著差异，而两者与8小时作用相比均有显著差异(P0.05)。
顺铂、高三尖杉酯、米托蒽醌和羟基喜树碱4种药物间不同剂量组在作用2小时时诱导Jurkat细胞的凋亡率无明显不同，在4小时和8小时时各组间均有显著差别(P0.05，图6）。药物诱导Jurkat细胞凋亡的强度依次为MIT、HCPT、HHT和CDDP。