一起流脑死亡患者的密切接触者咽部带菌调查
摘 要：对流脑死亡患者的密切接触者进行咽部带菌调查，为做好流脑防制工作及时提供科学依据。方法：采用常规的病原分离法和PCR法对密切接触者的咽拭标本进行检测。结果：19例密切接触者的咽拭标本经常规的病原分离法检出3株C群脑膜炎奈瑟菌，通过PCR方法检出4份标本含有脑膜炎奈瑟菌C群特异性核酸片段。结论：1例流脑死亡病例系由C群脑膜炎奈瑟菌所致。PCR法在流脑实验室诊断中其阳性率比常规的病原分离方法高。 总结大全 /html/zongjie/。
关键词：流行性脑脊髓膜炎；密切接触者；细菌培养；PCR。
2010年2月22日，上饶市疾控中心接到疫情报告，在弋阳县人民医院发现1例疑似流脑患儿，该患儿2010年2月20日出现高热、全身疼痛，家长以为普通感冒，让患儿在家服药休息。2010年2月22日因高烧不退，于当天上午9：30时入院，入院时体温39.3℃，出现意识障碍，颈项强直，皮肤出血点较多。血常规结果：白血球总数6.2×109个/L，中性粒细胞82.2%，脑脊液涂片查到G－双球菌。中午12：00时患者病情加重，立即转院南昌，经抢救无效当晚死亡。临床诊断该患儿为流行性脑脊髓膜炎。上饶市疾控人员立即对本起疫情进行流行病学调查，并前往弋阳县港口潘家村采集该死亡患儿19例密切接触同学的咽拭标本，带回实验室进行微生物学检验。 1 资料与方法 1.1 一般资料：标本来源：用无菌“7”形棉拭子采集与死亡患儿密切接触同学的咽拭标本19份。试剂与培养基：含抗生素卵黄双抗平板、卵黄琼脂平板、革兰染液、触酶试剂、氧化酶试纸均为青岛海博生物技术有限公司产品，PCR相关试剂盒为上海宝生科技发展有限公司产品。以上试剂均在有效期内使用。 1.2 诊断血清：脑膜炎奈瑟菌诊断血清为中国药品生物制品检定所提供。
思想汇报 /sixianghuibao/ 1.3 主要仪器：PCR扩增仪（MJ）、自动凝胶成像仪（UVP）、电泳仪。 1.4 方法：依照《流行性脑脊髓膜炎诊断标准和处理原则》GB16884—1997方法进行；PCR检测按常规PCR检测方法进行。 2 病原学检测 2.1 分离培养：用无菌“7”形棉拭子采集19例密切接触者咽部分泌物，立即接种卵黄双抗琼脂平板，烛缸保温运送。到实验室后放置于含5%～10% CO2环境中，35℃，培养24 h观察结果。在其中3块卵黄双抗琼脂平板上生长可疑菌落，菌落较大、圆形、无色、湿润。 2.2 纯培养：将3份可疑菌落接种于未加抗生素的卵黄琼脂平板上，置于含5%～10% CO2环境中，35℃培养24 h。 2.3 氧化酶、触酶试验：挑取3份可疑标本进行氧化酶、触酶试验，结果均为阳性（+）。 2.4 糖类发酵试验：挑取3份可疑标本进行糖类发酵试验，结果为：葡萄糖、麦芽糖均产酸不产气， 蔗糖、乳糖、果糖均为阴性。 2.5 革兰染色镜检：挑取3份可疑菌落进行革兰染色镜检，结果均为肾形排列，凹面相对，革兰阴性双球菌。 2.6 血清学：3份可疑标本血清学结果相同均为：多价Ⅰ（+）、多价Ⅱ（—）、多价Ⅲ（—）、A群（—）、B群（—）、C群（+）、盐水凝集（—）。 3 PCR方法 作文 /zuowen/ 3.1 样本处理：咽拭、脑脊液标本处理：取咽拭标本增菌液100 μl（脑脊液取1 ml）于EP离心管中，12 000r/min离心5 min，弃上清液，在沉淀中加100 μl裂解液，振荡混匀置100℃水浴10～15 min；12 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。 3.2 试剂配制：从试剂盒中取出PCR反应液、Taq酶，室温融化后。2 000 r/min离心10 s。设置需要的管数n（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），反应体系试剂配制：PCR反应液20 μl，Taq酶1 μl。在适当体积离心管中加入计算好的各试剂使用量，充分混匀，另取n个PCR反应管，分别加入21 μl混匀好的试剂。 3.3 加样：在设定的n个PCR反应管中分别加入处理过的样本、阳性对照、阴性对照（去离子水）3 μl，震荡混匀，于2 000 r/min离心5 s，将PCR反应管放入PCR仪中。 3.4 PCR扩增循环条件：首先预变性94℃ 5 min，然后94 ℃ 35 s、55℃ 35 s、72℃ 70 s，循环35次，最后72℃延长3 min。 3.5 配制琼脂糖进行点样：接通电源，电泳开始，电泳时间需30 min。 3.6 结果判断：在自动凝胶成像仪中读取数据。与阳性对照同一水平线出现的条带为阳性，未出现条带则为阴性。目的片断：流脑通用410 bp，A群400 bp，B群450 bp，C群250 bp。见图1。
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注：1、9、17：DL2000 DNA Marker；2：死亡患者（脑脊液）；3、4、5、6：密切接触者（咽拭）；8：阳性对照为流脑通用（410 bp）；7、15：阴性对照；10：死亡患者（脑脊液）；11、12、13、14：密切接触者（咽拭）；16：阳性对照为C群脑膜炎球菌SiaD（C）基因（250 bp） 图1 1份死亡患者脑脊液及4份密切接触者咽拭标本的PCR扩增结果 4 结果 19例密切接触者的咽拭标本经常规的病原分离法检出3株C群脑膜炎奈瑟氏菌，阳性检出率为15.8%，A群、B群均未检出。19例密切接触者的咽拭标本通过PCR方法检出4份含有脑膜炎奈瑟菌C群特异性核酸片段（其中包含3份病原分离阳性的标本），阳性检出率为21.1%，A群、B群均未检出。 5 讨论 脑膜炎奈瑟菌是流行性脑脊髓膜炎的病原体，常寄居于人的鼻咽腔和口腔黏膜上，通过呼吸道分泌物而传播。流行性脑脊髓膜炎发病高峰为冬末春初，感染者多为学龄儿童，感染后多数为隐性感染，不引起任何临床症状，健康人持续带菌时间从数天到几个月，脑膜炎奈瑟菌在一般情况下有5%～30%正常人带菌，带菌者是本病流行的重要传染源。在此次疫情处理调查中，该流脑死亡患者的脑脊液，因使用大量抗生素，只能涂片查到G－双球菌，未能分离到脑膜炎球菌，这对断定该流脑死亡患者的脑膜炎球菌群型造成困难。通过对其19例密切接触者的咽拭标本进行常规病原分离，分离出3株C群脑膜炎奈瑟菌，从而确定2010年上饶市1例流脑死亡病例系由C群脑膜炎奈瑟菌所致[1—2]。 总结大全 /html/zongjie/ 流脑起病急、病情发展快，是危害人类的呼吸道传染病之一，及时准确的诊断对流脑的治疗、预防至关重要。流脑的实验室常规诊断方法是从脑脊液（CSF）和血液等标本中分离病原菌，但使用抗生素治疗后，病原分离的阳性率明显下降。在该起疫情中对死亡患者培养呈阴性的脑脊液标本，进行了分子生物学检测，检出脑膜炎奈瑟菌C群特异性核酸片段，对19例密切接触者的咽拭标本进行检测，PCR法的阳性率比常规的病原分离法高。此方法可以快速检测不同标本中的极少量细菌，而且抗生素的应用对它的检出影响不大，并且在接到标本后4～5 h即可做出诊断，可以在疾病的早期辅助临床诊断，弥补传统方法检测时间长的不足。参考文献：[1] 倪语星,尚 红.临床微生物学与检验[M].北京:人民卫生出版社,2007:96.[2] 原 灵,郭维植,陈爱平,等.3例C群脑膜炎球菌引起的流脑病例报告[J].中国自然医学杂志,2008,2(1):46.