涎腺腺样囊性癌转移细胞株的Notch基因表达
【摘要】 目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因,并对其进行初步验证。 方法 限制片段差异显示PCR技术(RFDD—PCR)构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC—M、ACC—2)基因表达谱,生物信息学分析两个表达谱的Notch基因,半定量RT—PCR技术对两细胞株的Notch基因差异表达进行验证。 结果 用RFDD—PCR方法成功构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC—M、ACC—2)的表达谱,共获得5 420个基因片段,其中包含3个Notch基因。半定量RT—PCR证实Notch2、Notch4在ACC—M的表达高于ACC—2,Notch1在两表达谱未见表达,半定量RT—PCR发现其在ACC—M的表达高于ACC—2。Notch3在两个细胞株表达的差别无统计学意义。 结论 Notch1、Notch2、Notch4可能与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关。
【关键词】 癌,腺样囊性; 涎腺肿瘤; 基因表达谱; 逆转录聚合酶链反应; 基因。
ABSTRACT: Objective To screen candidate genes related to cancerometastasis and adenoid cystic carcinoma. Methods Restriction fragments differential display PCR(RFDD—PCR) was used to set up gene expression profiles of adenoid cystic carcinoma cell lines—ACC—M and ACC—2 with high and low metastasis potential respectively. Candidate genes were screened through bioinformatics analysis. The expression of 4 genes of Notch family was assessed by semi—quantitative RT—PCR. Results Two gene expression profiles including 5 420 gene fragments were constructed, 3 genes of Notch family were observed in these two cell lines. Semi—quantitative RT—PCR identified that 3 gene of Notch were Notch1, Notch2, and Notch4. Conclusion Notch1, Notch2, Notch4 may be related to carcinogenesis and metastasis of adenoid cystic carcinoma.
KEY WORDS: carcinoma,adenoid cystic; salivary gland neoplasms; gene expression profiling; reverse transcriptase polymerase china reaction; genes。
恶性肿瘤的浸润、转移是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,也是恶性肿瘤患者主要致死原因。近年来研究发现,Notch基因改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病、心血管病变等多种疾病的发生发展有密切关系。笔者从基因组的整体水平,观察Notch基因在涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株间mRNA表达的差异,为临床寻找更为敏感的转移相关指标提供参考。
1 材料和方法。
1.1 材料。
1.1.1 细胞与试剂 人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC—M)和低转移细胞株(ACC—2)由上海第九人民医院口外肿瘤实验室惠赠。Trizol试剂(美国 Invitrogen公司);第2代差异显示试剂盒/DISPLA YPROFILETM Kits(美国Q—biogene公司);Cy5荧光标记试剂盒(英国Amersham Biosciences公司);Rnase抑制剂、逆转录酶(美国Promaga公司);Taq DNA聚合酶、DL—2000 DNA Marker［中国宝生物工程(大连)有限公司］;Notch等引物(上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司合成)。
1.1.2 主要仪器 紫外可见分光光度计(美国Bio—Rad公司);Mastercycler Gradient 5331 PCR仪(德国Eppendorf公司);Typhoon9200荧光成像系统(英国Amersham Biosciences公司);高压垂直电泳系统(美国Bio—Rad公司);GeneSnap凝胶成像系统(英国SynGene公司)。
1.1.3 生物信息学工具 数据库;GeneBank数据库;IMAGETOOL软件;Imagequant软件(Amersham Biosciences,v2003.02);GeneTools软件(SynGene,Version 3.00.22);SAS软件等。
1.2 方法。
1.2.1 表达谱构建 Trizol试剂提取ACC—2、ACC—M的总RNA;根据两样品浓度不同取相应体积的总RNA(相当于1 μg),以随机锚定引物5’T25V合成cDNA;利用TaqI限制性内切酶位点一般位于编码区外的特性,将两样品cDNA用TaqI限制性内切酶进行消化,与两种特殊设计的接头混合相连;以64种差异显示引物分别对2种细胞株的转录组片段进行扩增;引物的特殊设计可以使扩增产物覆盖所有转录组片段,引物以Cy5荧光标记;采用6%尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离、显示各转录组片段,在荧光成像系统上扫描凝胶,获得表达谱电泳图像［1］。
1.2.2 表达谱生物信息学分析 图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离。SAS统计软件进行曲线拟合,找出最佳拟合曲线,计算各片段bp值。以片断大小和所在“表达窗”作参数,按2%容许误差从数据库（Qbio—gene Inc. MPBiomedicals Inc公司提供）确定其所对应的基因,每个片段数据均与NCBI GeneBank直接链接。
1.2.3 Notch基因表达 确定筛选出的Notch各基因在表达谱的位置及大小(bp),比较其在2个基因表达谱间的表达差异。
1.2.4 半定量RT—PCR验证Notch基因的差异表达 Trizol试剂提取涎腺腺样囊性癌细胞株ACC—2、ACC—M的总RNA;紫外可见分光光度计测定样品D(260 nm)及D(280 nm),根据D(260 nm)将两样品总RNA稀释至相同浓度;各取总RNA用逆转录酶2 μg逆转录为cDNA;等量取cDNA用相对应的引物对Notch的基因片段进行扩增。引物序列及扩增条件见表1。
PCR循环程序:预变性94 ℃,2 min;变性94 ℃,30 s,退火温度见表1,时间30 s,延伸72 ℃,30 s,循环次数见表1;72 ℃,10 min结束反应。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离片段。电泳后凝胶条带经GeneSnap成像后用GeneTools进行半定量分析,结果用各个基因扩增条带的灰度值与内参照β—actin的灰度值的比值表示。所有RT—PCR均行3次试验,两个细胞株Notch基因RT—PCR与内参相对信号强度的比值用均数方差分析。