活血渗湿方对实验性肝纤维化的作用研究
作者：张永生 卢良威 蔡卫民 翁红雷 刘清君 陈群伟。
【摘要】 ［目的］确定活血渗湿方抗实验性肝纤维化的疗效。［方法］用经典四氯化碳肝纤维化模型进行活血渗湿方药效试验,并与复方鳖甲软肝片、干扰素等进行对照观察。［结果］血清HA检测、病理组织学观察显示活血渗湿方治疗组、IFNγ治疗组及复方鳖甲软肝片治疗组之间均无显著性差异(P0.05),但与生理盐水阴性对照组比较差异显著(P0.05)。［结论］活血渗湿方具有显著的抗实验性肝纤维化的作用。
【关键词】 肝纤维化;活血渗湿方;复方鳖甲软肝片;干扰素;实验研究。
Abstract: ［Objective］ To define the therapeutic effect of BDD’s antiliver fibrosis.［Methods］ Take classical carbon tetrachloride liver fibrosis model to make pharmacodynamic test of BDD and compare it with Fufang Biejia Ruangan tablets (FBRT) and Interferon γ( INFγ).［Results］ By observing serum HA test，pathology and histology，it indicates that there is no marked difference among BDD treatment group，IFNγ treatment group and FBRT treatment group (P0.05)，but there is obvious difference compared with normal saline negative control group ( P0.05).［Conclusion］ BDD has the function of antiexperimental liver fibrosis.
Key words： liver fibrosis，BDD，FBRT，INFγ，experimental study 肝纤维化是各种慢性肝病（包括病毒性、酒精性、血吸虫性等）的共同病理学基础，是发展至肝硬化的必经阶段。有研究表明慢性肝病发展到肝纤维化或早期肝硬化时是可逆的，但如果发展到晚期肝硬化就不可逆转了。所以肝纤维化尚未发展到肝硬化前，及早阻断和逆转肝纤维化，是防治慢性肝病致肝硬化的关键［1］。活血渗湿方是导师卢良威教授在长期的临床研究中总结出来的经验方，在临床应用及前期的实验研究中已经初步显示出了显著的抗肝纤维化作用［2］。本研究旨在研究活血渗湿方抗肝纤维化的疗效。
1 材料与方法。
1.1 实验材料 SD大鼠200只，雌雄各半，清洁级，体重180～220g，购自中科院上海实验动物中心，由浙江中医药大学实验动物中心提供饲养条件，自由饮水，预养10天后进入实验阶段。
1.2 药物 活血渗湿方浸膏制剂：方药由穿山甲、山慈菇、黄芪、茯苓及水红花子等组成，由浙江中医药大学中医门诊部提供，用自动煎药机制备，浓缩成为生药含量为6g·ml—1的浸膏备用。干扰素γ：由上海克隆生物高技术有限公司制造，100万IU/支，批号：970521。复方鳖甲软肝片：由内蒙古集宁制药厂制造，0.5g/片，批号：20000903。
1.3 模型制作及分组 设正常组大鼠20只。其余SD大鼠用于肝纤维化模型的制作。将四氯化碳与橄榄油按4∶6比例配成40%油剂。按0.3ml/100g体重课题皮下注射，2次/周。每周末随机处死2只大鼠观察肝脏组织学变化，直到中度肝纤维化形成。分组：造模8周后，中度肝纤维化形成，随机选取10只模型大鼠作为干预前对照。将模型大鼠随机分为以下几组，给药剂量按照“等效剂量”的换算方法计算活血渗湿方、复方鳖甲软肝片及干扰素的等效干预剂量如下。 (1)活血渗方干预组：以活血渗湿方复方煎液按10g·kg—1生药量灌胃，1次/天；(2)复方鳖甲软肝片阳性对照组：软肝片用蒸馏水溶解，按0.625g·kg—1体重灌胃，1次/天；(3)IFNγ阳性对照干预组：IFNγ20万U·kg—1体重，肌注，1次/天；(4)生理盐水阴性对照组：以生理盐水2ml/100g灌胃，1次/天；(5)另设正常对照组20只，灌服同样剂量的生理盐水。 每周称量大鼠体重以调整药物的剂量，连续用药12周后，取血，处死大鼠，取大鼠肝脏置中性福尔马林液中固定，行常规HE染色、特殊染色及免疫组织化学标记染色。
1.4 观察指标。
1.4.1 血清学 全部大鼠摘取眼球取血，分离血清进行肝功能检测，包括血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALb）、白／球蛋白比例（A/G）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）等生化指标；并检测大鼠血清透明质酸（HA）。
1.4.2 组织学观察 取大鼠肝脏左、右叶各1块，立即用10%中性磷酸缓冲液（PBS，pH=7.0，以下同）福尔马林液中固定，固定过夜后取材，按1×1×0.2cm大小，标记后流水冲洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡，常规石蜡包埋切片，进行常规染色及特殊染色和免疫组织化学检测。 评定标准：HE染色，观察肝组织炎症和汇管区纤维化情况，与苦味酸—天狼红染色对照，判定炎症和纤维化程度并记分；苦味酸—天狼红染色：显示肝组织胶原增生情况，与常规病理学的HE染色对照，并且在偏光显微镜下区分Ⅰ、Ⅲ型胶原，判定肝组织纤维化程度并分级；氨银－Masson网织纤维染色，采用“氨银－渡边改良法”进行氨银媒染并显示肝窦基底膜增生和网织纤维分布情况，与HE染色和苦味酸——天狼红染色共同对照观察，判定纤维化程度［3］。
按实验动物肝纤维化组织学Ⅵ级标准进行肝纤维化程度评判［45］。０级—正常肝组织；Ⅰ级—少量胶原纤维自汇管区或中央静脉向外延伸；Ⅱ级—纤维延伸明显，但未包绕整个肝小叶；Ⅲ级—纤维互相连接包绕整个肝小叶；Ⅳ级—纤维分隔肝小叶形成假小叶，但以大方形假小叶为主；Ⅴ级—假小叶中大方形假小叶和大圆形假小叶各占50%；Ⅵ级—肝内布满小圆形假小叶，其间充满粗大增生的纤维组织。其中Ⅳ级为早期肝硬化（肝纤维化），Ⅴ～Ⅵ级为肝硬化期。
1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行数据的统计分析，血清TP、ALb、A/G、ALT、AST、HA及羟脯氨酸含量均以均数±标准差表示。先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件的行单因素方差分析，组间比较应用Student—Newman—Keuls检验，纤维化积分采用秩和检验，P0.05，差异有显著性意义。
2 结果。
2.1 一般情况 总计200只SD大鼠，肝纤维化模型复制成功108只，进入干预阶段。随机选取10只，作为干预前对照。在实验过程中有56只大鼠死亡，除去每周处死用于前期每周肝纤维化程度观察的大鼠16只，复制过程中大鼠的死亡率达28%，与国内外的文献报道相仿。在大鼠模型复制过程中，大鼠的皮毛逐渐变得直立，色泽无光，体重的增长不明显，消瘦，进食量下降，大便稀溏，容易受到外界刺激的影响。与正常的大鼠有明显的不同。
2.2 肝功能检测（见表1） 肝功能TP、A/G、及AST检测各组之间均无统计学意义（均P0.05）；正常组与模型组大鼠肝功能Alb、ALT检测有统计学意义，差异显著（P0.05）；活血渗湿方、复方鳖甲软肝片及IFNγ组间肝功能各项检测比较差异不显著，无统计学意义（P0.05）。