人胚肺间充质干细胞对损伤肺组织的修复作用
作者：刘伟 钱东华 钱明 彭丽萍。
【摘要】 目的 研究人胚肺间充质干细胞(MSCs)对损伤肺组织的修复作用。方法 通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人MSCs对肺上皮细胞的生长调控。结果 人胚肺MSCs能有效调控肺泡上皮的生长。结论 人胚肺MSCs及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗COPD、病毒性肺炎造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。
人胚肺间充质干细胞(MSCs)可在体外扩增培养，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变，处于G0/G1期的细胞多，具有典型的干细胞增殖特点，其免疫表型与骨髓来源的MSC相似〔1〕，能够被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种组织细胞,为肺损伤的治疗提出了一个新的思路。本研究通过动物体内实验和细胞体外培养实验，观察人胚肺MSCs对肺上皮细胞的生长调控，证实在肺脏损伤后，人胚肺MSCs及其条件培养液可以减轻人肺上皮损伤和加速修复，从而为临床治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、病毒性肺炎等造成的肺损伤提供新的生物治疗方法。
1 材料与方法。
1.1 MSC调控肺上皮细胞生长实验 动物体内实验：选用无免疫排斥反应的NOD/SCID小鼠并制备呼吸道上皮、肺泡上皮损伤模型。NOD/SCID小鼠经过137铯照射300 cGy。 分别输入荧光燃料标记的人胚肺MSCs、人骨髓MSCs，定期通过肺组织切片和PCR检测外源基因，观察细胞移植和生长情况。经尾静脉输入胎肺来源的PKH26荧光染料染色的MSCs 1×106和NOD/SCID鼠自身的骨髓1×107，2个月后小鼠断颈处死，肺脏组织冰冻切片，荧光显微镜观察PKH26荧光阳性的细胞分布。肺脏组织提取基因组DNA，PCR测定人源性特异基因Amelogenin,上游引物：5′ACCTCATCCTGGCCACCCTGC3′,下游引物5′AGGCTTGAGGCCAACCATCAG3′。PCR条件是96℃变性5 min,94℃变性1 min,60℃退火1 min,70℃延伸1 min,共30个循环，最后70℃延伸10 min。分别输入两种干细胞和条件培养液给肺损伤模型鼠，观察肺上皮损伤修复速度和程度。
1.2.1 建立人胚肺MSC滋养层细胞培养体系(方法同上)。
1.2.2.1 主要试剂 蛋白酶型内皮细胞生长支持物(ECGS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素(INS)、转铁蛋白(TF)、甲状腺素(T3)、氢化可的松(HC)、抗角蛋白抗体、人胎盘胶原(HPC)均为Sigma产品，LSAB免疫组化试剂盒为Dako产品，MEM、DMEM/F12培养基、胎牛血清FCS为Gibco产品，L谷胺酰胺为Merck产品，余为国产分析纯。
1.2.2.2 培养器皿 24孔板为Coring产品，套皿(MillicellCMΦ12 mm)为Millpore产品，套皿用HPC按20 μg/cm2涂膜置室温18 h弃去多余HPC，室温干燥，临用前用PBS洗涤24孔板涂膜同上。
1.2.2.3 培养基配制 在DEMEM/F12培养基中加入10 μg/ml INS、0.4 μg/ml HC、5 μg/ml TF、20 ng/ml T3、25 ng/ml ECGS、1 mmol/L谷胺酰胺、100 IU/ml青霉素、50 μg/ml链霉素为无血清培养基。
1.2.2.4 气管上皮细胞分离和培养 新鲜气管标本取自意外死亡的健康成人，由本院提供无菌条件下，用冰冷PBS冲洗纵向。切开气管，机械剥离黏膜层，剪成23 mm长小片。同上PBS冲洗置于含蛋白酶0.5 mg/ml PBS中4℃过夜消化。用漩涡震荡器剧烈震荡消化后的黏膜碎片10余秒，吸管轻轻吹打数分钟，加FCS至终浓度为2.5终止酶反应，1 000 r/min离心10 min，弃上清MEM洗涤细胞2次。用含5FCS的DMEM/F12培养基配置成细胞悬液，台盼蓝拒染色检测活细胞数，按2.5×109个活细胞/cm2加入套皿，5% CO237℃培养24 h后换为无血清培养基，隔日换底层培养液一次。设置常规24孔板无血清培养为对照。
1.2.2.5 人胚肺MSCs对成人气道平滑肌细胞生长的影响 将前述获得的人胚肺MSCs贴壁细胞用胰酶消化，收集所有贴壁细胞，1 000r/min离心，洗涤2次后，计数，取10 ml同时加入0.8%甲纤素，15%MCM，30%人AB血清及适量IMDM，以1×106细胞加入24孔板平滑肌的培养基，未加入人胚肺MSC的气道上皮细胞为对照组，放入37℃5%CO2饱和湿度培养箱内，共同培养10～12 d，40～50个细胞为1个集落，观察气道平滑肌的生长情况，测定人胚肺间充质干细胞对气道平滑肌生长情况的影响(以细胞集落数计算)。
1.3.1 滋养层系统的建立方法同上。
1.3.2 胚胎肺上皮细胞体外培养 采用组织块贴壁培养法，对药物引产的3～5个月胎龄胎儿肺组织进行原代培养，于5% CO2，37℃培养箱内培养，待细胞生长汇合后，采用0.05%胰酶、乙二胺四乙酸钠消化进行传代培养;培养基为含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的RPM1640(Gibco/BRL)。细胞按1∶3比例稀释，2～3 d细胞生长至饱和进行常规传代培养。