老年骨质疏松动物模型韧带胶原蛋白含量测定
作者：王成学 谷贵山 胡春明 张伟。
【摘要】 目的 测定正常对照组和老年骨质疏松动物模型组前交叉韧带的胶原含量，为临床提供生物力学参数。方法 采用改良的羟脯氨酸（HPR）测定法测定两组标本的胶原蛋白含量。结果 正常对照组胶原含量为（41.2±3.6）mg/g，模型组胶原含量为（36.4±2.9）mg/g。结论 骨质疏松模型组前交叉韧带胶原蛋白含量降低，说明骨质疏松对韧带胶原含量具有一定影响。
以往关于动物骨质疏松模型骨的生物力学、生物化学研究较多，关于骨质疏松动物模型韧带软组织胶原蛋白含量测量国内未见报道。预防和治疗骨质疏松有必要定量的了解动物骨质疏松模型胶原含量，以确定其对韧带胶原含量的影响。本研究对正常和骨质疏松大鼠模型膝关节前交叉韧带胶原含量进行测定，比较了正常大鼠和骨质疏松模型大鼠膝关节前交叉韧带胶原蛋白含量的差异。
1 材料与方法。
1.1 动物分组 选用体重280～320 g，10月龄雌性Wistar大鼠由吉林大学动物实验部提供。饲料购自沈阳市动物饲料厂（产品标准代号：DD21741P3）。将40只大鼠分成两组，组间体重无统计学差异（P＜0.05），分别设为正常对照组20只，实验组20只，所有动物饲料条件一致，自由摄食和饮水。实验组动物于0 w摘除双侧卵巢，两组大鼠饲养14 w后以腹主动脉放血法处死大鼠，取大鼠膝关节前交叉韧带立即进行测试。
1.2 方法 测试仪器为25 μl、250 μl加样器，1712MP8型全自动电子分析天平（德国SartoriusLtd生产），722型光栅分光光度计（上海市第三分析仪器厂生产）。采用改良的羟脯氨酸（HPR）测定法〔1～4〕。
1.2.1 软骨脱脂 将切成薄片的软骨置20 ml试管中，加丙酮2次，各6 h弃去，最后用乙醚脱脂1次过夜。将已脱脂软骨剪碎，置于50℃恒温箱中干燥4 h。
1.2.2 提取胶原 干燥后，每份样品取50 mg，置10 ml带盖试管中，加入0.3 mol/L三氯醋酸(TCA)溶液3 ml，置90℃恒温箱内1 h，冷却后离心（3 500 r/min）5 min，放置20 ml洁净试管中；沉淀中再放入0.3 mol/L TCA 2 ml，依上法提取1次合并上清于前一提取液中。将盛有提取液的试管置于烘箱中120℃蒸干。
1.2.3 待测样品制备 蒸干后的试管中加入6 mol/L HCl溶液2 ml，溶解后移入6 ml洁净安瓶中，封口，120℃水浴中10 h。取水解液20 μl，加蒸馏水6 000 ml振荡后配成待测样品。
1.2.4 羟脯氨酸（HPR）测定 取待测样品1 ml，加入0.05 mol/L GuSO4溶液0.5 ml及10％NaOH溶液0.5 ml，再加入6％H2O2溶液0.5 ml，置30℃水浴10 min，其间振荡。加入无水乙醇0.5 ml，再放置20 min，其间振荡3次；加6 mol/L HCl 1 ml，再加5％对二甲氨基苯甲醛1 ml摇匀，于50％水浴15 min，自然冷却后，测540 mm的吸光值。
1.2.5 标准液配置 取2 mg标准HPR溶于50 ml容量瓶中，配成储备液50 ml。实验时按0、2、4、6、8……16 g/ml稀释成不同浓度，与待测样品同步测定吸光值。
1.2.6 计算样品HPR浓度及胶原含量 样品HPR浓度=标准HPR浓度×所测样品吸光值/标准HPR此浓度吸光值；样品中（1 ml水解物）胶原含量百分比=样品HPR浓度/组织量×D×100（D为计算常数=7.46）〔5〕。
1.3 统计学处理 采用数理统计分析法对实验数据进行统计分析，采用配对t检验对两组胶原含量进行t分析。
2 结 果。
正常对照组动物前交叉韧带胶原含量为（41.2±3.6）mg/g。实验组胶原含量为（36.4±2.9）mg/g，两组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。