早期死亡时间推断的法医学研究现状
作者：楼旭鹏 许小明 龚志强。
【摘要】 精确的早期死亡时间推断在法医学领域中是一个非常重要但迄今仍未能完全解决的问题之一。本文笔者综述了近年来国内外学者采用较先进的技术与方法从不同角度对此问题的法医学研究现状。如何将这些研究成果变成可供早期死亡时间推断精确量化的标准与指标，还有待于今后国内外法医学者进一步的努力研究。
【关键词】 法医病理学; 死亡时间;死亡时间推断 【Abstract】 Exact estimating of early postmortem intervalis one of the important problems in forensic medicine, but so far it has not been solved. The author reviews some advanced technologies and methods which are adopted by the internal and overseas scholars nowadays and discusses the status about the problem from different directions. How to change these achievements into standards and targets to quantify the time since death still needs great efforts for the scholars who work in the forensic area.
【Key words】 forensic pathology；postmortem interval(PMI)；estimation of time since death。
死亡时间（time of death）法医学上是指死后经历时间（the time since death,TSD）或称死后间隔时间(postmortem interval,PMI),即发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间推断（estimation of time since death）是指推测死亡至尸体解剖时经历或间隔时间。死亡时间推断是法医学鉴定首先要解决的问题，对这一问题重要性的认识已经历了数个世纪，为此人们不断探求新方法、新技术，历求从不同角度寻找最优出路。死亡时间又分为早期和晚期，早期死亡时间是指尸体未出现明显腐败现象的时期，对于法医鉴定来说更常用也更重要。本文就国内外在这方面的研究现状做一重点介绍。 1 红细胞钾离子含量 死后血清钾离子含量变化国内外已见诸报道，而对死后红细胞内钾离子含量变化的研究较少。据Laiho和Querido报道［1，2］，红细胞内钾离子含量随死亡时间延长呈线性下降。1999年谷建平等报道［3］家兔死后随死亡时间延长红细胞内钾离子含量逐渐减少；钠离子含量在死后l2h变化不大，以后逐渐增加。红细胞内钾含量与死亡时间呈线性负相关(r=—0.829，P0.025)，死亡时间(X)与红细胞内钾离子含量(Y)的直线回归方程为：Y=7．56—0．071X或X=106．48—14．08Y(Y的单位以mmol／1012RBC.h表示,单位为小时)。 2 骨骼肌pH值 Philip C等［4］ 对大鼠死后骨骼肌的研究表明，糖原磷 酸化酶在大鼠死后很快被激活，导致肌糖原开始磷酸解，由于死后血液停止生理循环，组织得不到氧供，糖原分解所得的葡萄糖进行酵解，产生乳酸（1actic acid，lacate，LA），最终使肌肉中乳酸堆积，pH值下降；随着这一过程进行，细胞内溶酶体破裂，释放出大量水解酶，在低于生活细胞的pH环境下，各种水解酶亦被激活，参与到糖原分解中，这就是死后组织的自溶。上述过程持续进行直到肌肉中糖原储备耗竭为止。党永辉等［5］利用KNIpHE电极［6］对大鼠死后不同时间骨骼肌pH值进行测定，同时测定骨骼肌内乳酸和肌酸激酶(cre—atine kinase，CK)浓度来比照pH值，探讨死后骨骼肌pH值与早期死亡时间(PMI)之间的关系。实验研究结果表明死后一定时间内，pH值下降与LA浓度有较高负相关性( r=—0．892，P0.001)，理论上说明pH值的下降与乳酸堆积有关；而大鼠死后骨骼肌pH值在12h内呈下降趋势，且与PMI线性相关，回归方程为PMI=115.499—17.7pH (R=0．662，P0.01)，初步说明死后pH值可以用来推断早期死亡时间。
环境温度、死前状态对死后肌肉pH值有影响，探索这种影响的大小、作用方式以及是否还有其他影响因素，并最终在案发现场应用是该课题研究的未来方向。
以往对死亡时间的推断主要集中在分析各种尸体现象、胃肠内容物消化程度、超生反应、离子浓度、昆虫学，在组织细胞学、生物化学、分子生物学领域内的也有研究，但在机体损伤性死亡后，其心肌骨骼肌肌动蛋白的变化与死亡时间的关系研究较少。吕江明等［7］用免疫组化S—P法，观察大鼠死后心肌及骨骼肌抗肌动蛋白单克隆抗体(HHF35)染色变化，探讨心肌及骨骼肌肌动蛋白变化与死亡时间的对应关系。结果发现，在大鼠死后54h内，心肌、骨骼肌呈不同程度的HHF35缺染，其面积随死后时间的延长而增大。经对IBSA图像分析数据进行方差分析(F心肌=588.27，F骨骼肌=351.25，P0.05)，差异有显著性；经逐步回归分析(心肌=0.943，F骨骼肌=0.958，P0.05)，具有正相关关系。所建方程y心肌=—30.568+1.003x1，y骨骼肌=—24.897+0.986X2(X为HHF35缺染面积均数)具有统计学意义。结论，在一定时间内，大鼠死后不同时间心肌骨骼肌细胞HHF35缺染面积，随死后时间的延长而增大。同时对死后心肌及骨骼肌细胞两组间HHF35缺染变化的图像分析数据进行t检验，发现二者无差异。表明在应用肌动蛋白含量变化推测死亡时间时，心肌与骨骼肌细胞的HHF35缺染变化具有相同的参考价值。
4 玻璃体液酶活性变化 死亡时间的推断早有学者认为眼球玻璃体液生化检测较为合适［8］，但检测方法和手段受限。2005年，王伟平等［9］应用光度法检测在25%～30％和10%～15％下死后即刻至54h之间玻璃体液胆碱酯酶(choline esterase，CHE)和谷草转氨酶(glutamicoxaloacetic transaminase，GOT）活性。结果死后即刻至54h之间，CHE、GOT活性分别由约850U／L、220U／L逐步降解趋于零。死后6h内，两种酶活性降解存在平台期。统计分析，得出相应的单元和多元回归方程，相关系数或决定系数均在0.896以上，P0.01。由此得出结论，两种酶活性的降解规律可作为较为客观的推断PMI的参考指标。
5 DNA水平。
死后组织细胞DNA含量随PMI的延长而呈下降趋势，已被众多学者所证实［10］。2000年刘良等［11］首次利用计算机图像分析技术(Image Analysis Technique，IAT)，对大鼠死后组织细胞DNA含量变化与PMI的关系进行了一系列研究，机体细胞核DNA平均含量对于同一物种来说是恒定不变的，而随着死后经过时间的延长DNA含量有规律的下降，据此确立了建立多参数、多脏器、多元回归方程的可行性，给法医学早期PMI的推断提供了一种崭新的、富有前景的方法。但在实验技术逐渐成熟的过程中发现一些问题，如各实验结果的可比性、重复性差，难以在法医学实践中推广。2004年何方刚等［12］提出了规范化的工作流程及判断标准。同一个体不同组织的细胞DNA降解速度及先后顺序不同，因此推断死亡时间的器官选择至关重要，肝、脑、脾可以作为推断早期PMI的合适器官，而以脾为最合适［13］。取材方法以细针穿刺细胞学涂片方法，可以减少操作上的人为干扰，并且穿刺吸取部位可选择器官的中心，在一定程度上排除了人为因素和外界因素的影响。细胞核DNA含量应以单个完整细胞核为计量基础，涂片较切片能更好地保持细胞本身的形态，而且操作简单，易于推广。取材涂片后应在10s内立即固定，甲醛氧化产生的乙酸在组织中与血红蛋白结合，形成棕色色素颗粒影响染色后观测，选择冷Carnoy液固定能较好的克服这一缺陷，它对细胞核和染色体固定效果好，且固定速度快。样本含量确定方面，一般将每张涂片分成9个视野，随机取6个视野，每个视野随机采一幅图像，每幅图像取随机10个细胞，通过适当增加第一层样本含量即可满足对总体推论的需要。 由于死后DNA含量的变化受环境温度、淤血程度、细菌繁殖、损伤程度及所在部位的影响，这些影响会造成一定的偏差。所以，在今后的动物或人体实验中，是否严格控制或部分控制有关因素，以及控制后的校正问题，是一个值得探讨的课题。
6 RNA水平。
死后组织细胞DNA含量变化与PMI关系的研究较多［14］，但组织RNA含量变化与PMI的关系却少有报道。肖俊辉等［15］采用逆转录一聚合酶链反应(Reverse tran—sefiptase—polymerase chain reaction，RT—PCR)技术，检测了死后不同时间大鼠心肌和膈肌组织B肌动蛋白mRNA(B—actin mRNA)的变化，为早期PMI的推断提供了新的指标和实验依据。肌动蛋白(actin)是细胞结构蛋白，是细胞微丝的基本成分。根据其亚单位构造的不同可以分为αβγ三种异构体。在大鼠等动物中发现，mRNA的表达几乎不随年龄的改变而发生变化［16］。因为β—actin在细胞内稳定，常被作为衡量比较细胞内其他因子变化的参数指标。该实验结果提示，β—actin mRNA在死后组织仍然具有一定的稳定性，随着死亡时间的延长，扩增产物减少并最终消失，其死后变化可能存在一定的规律性，利用RT—PCR方法检测死后组织mRNA，可望为死亡时间推断提供新的思路。但其具体变化规律还有待进一步研究。