X射线照射诱导鼻咽癌细胞hMSH2的表达

【摘要】 目的 研究X射线照射对鼻咽癌CNE1细胞错配修复基因hMSH2表达的影响，探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA修复机制。方法 应用逆转录PCR（RTPCR）、免疫细胞化学及蛋白免疫印迹（Western blot）方法，检测X射线照射后对照组和实验组（照射总剂量分别为0Gy和10Gy）细胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表达。 结果 实验组细胞hMSH2 基因mRNA及蛋白表达在照射终止后逐渐上调，其表达较对照组显著增强（P0.01）。结论 X射线照射可诱导鼻咽癌细胞hMSH2的表达，有助于放射损伤后肿瘤细胞DNA修复，这可能是肿瘤放疗敏感性降低的原因之一。

【关键词】 X射线 鼻咽癌 hMSH2; RTPCR 免疫细胞化学。

0 引言 　　目前在恶性肿瘤放射治疗中，常出现肿瘤放疗敏感性降低的现象，这涉及到肿瘤本身的生物学特性及某些癌基因和抑癌基因的改变，但迄今为止尚未见到有关错配修复（mismatch repair，MMR）基因在其中有何作用的报道。研究证实，MMR基因能够纠正DNA复制过程中产生的碱基错配，保证基因组的完整性和稳定性，其中hMSH2基因在错配修复过程中起着关键作用[1]。本研究选用临床上以放射治疗为首选的鼻咽癌细胞为研究对象，应用逆转录PCR（RTPCR）、免疫细胞化学及蛋白免疫印迹（western blot）方法，检测X射线照射后鼻咽癌CNE细胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表达，分析放射对hMSH2基因表达的影响，探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA修复机制，为增强肿瘤放疗敏感性及指导临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法。

1.1 CNE1细胞株 　　CNE1细胞株由中国科学院上海生物学研究所提供, 该细胞株的来源及生物学特性参见文献[2]。用含10%小牛血清RPMI 1640培养液，于37℃、100%饱和湿度、95%空气+5% CO2条件下的CO2 孵箱培养，常规传代，待细胞进入指数生长期后进行实验。

1.2 照射条件及方法 　　取指数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，按梯度稀释法用细胞培养液调整到合适的细胞浓度，将其接种于数个培养瓶中，放置于CO2 孵箱中培养至细胞完全贴壁。照射源为6MV X直线加速器，剂量率为200cGy/min，射野大小为10cm×15cm, 把培养瓶置于照射野中心。照射前对培养瓶进行衰减校正。将细胞分为对照组和实验组，每次照射剂量分别为0、2Gy，1次/天，总剂量分别为0、10Gy。每次照射后将细胞放回CO2孵箱内继续培养，照射全部结束后立即收集两组部分细胞，其余细胞每周收集1次，共收集5次，冻存备用。

1.3 RTPCR方法检测hMSH2 mRNA的表达 　　用Trizol试剂分别提取两组细胞总RNA，经AMV逆转录酶系统合成cDNA。逆转录系统构成如下：RNA 1μg，随机引物0.5μl,dNTP 1μl, AMV逆转录酶0.5μl, RNase 抑制剂0.25, Mgcl2 2μl,10×Buffer 1μl,加RNase灭活蒸馏水补充至10μl。PCR反应系统构成如下：5×PCR Buffer 10μl， TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25μl, hMSH2基因及内对照βactin上、下游特异性引物各0.5μl，加灭菌蒸馏水补充至40μl。从基因bank查出hMSH2和βactin的引物序列， hMSH2： 5′GTCGGCTTCGTGCGCTTCTTT3’，5′TCTCTGGCCATCAACTGCGGA3’，扩增产物429bp；βactin： 5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3’，5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3’，扩增产物 621bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。扩增条件：94℃ 5min，94℃ 30s，59℃ 30s ，72℃ 45s，共30个循环，最后72℃ 10min。取10μl PCR产物在2% 琼脂糖凝胶电泳分离， UVP凝胶成像系统扫描照相，计算hMSH2与βactin基因RTPCR产物吸光度的比值，以此作为hMSH2 mRNA的相对含量。

1.4 免疫细胞化学检测hMSH2蛋白的表达 　　取两组细胞涂片，参照试剂盒（Zymed公司）说明书，进行链酶亲和素过氧化物酶(streptavidinperoxidase, SP)法免疫细胞化学染色。鼠抗人hMSH2单克隆抗体（Zymed公司）使用时稀释度为1∶50。用已知表达阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下观察到细胞核存在棕黄色颗粒为hMSH2阳性。采用HPLAS100彩色图像分析系统检测阳性细胞吸光度值。

1.5 Western blot法检测hMSH2蛋白的表达 　　将两组细胞分别加入200μl细胞裂解液(50mmol/L TrisHcl pH 8.0、150mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、1% triton X100、1mmol PMSF)，沸水煮5min，冰浴上超声粉碎，4℃离心5min（11 000rpm），取出上清液，用BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）进行蛋白定量。取蛋白样品50μg，采用SDSPAGE电泳进行蛋白转膜，加入5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(1:150)和二抗（1∶1 000）孵育，ECL显色。实验重复3次。UVP成像分析系统扫描确定蛋白印迹条带的光密度值，以此表示蛋白含量。