肠道病毒71型分子生物学研究

【摘要】 就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。

【关键词】 肠道病毒 71型 基因型 分子流行病学。

Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic, replication, diagnosis technology, EV type identification and molecular epidemic science.

Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science 　　近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。

1 病毒的一般特征。

1.1 病毒颗粒结构及理化性质 肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员［1］。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPI.VP3上（见图1）。由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。

图1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构（略）。

1.2 基因组结构［2］ EV71基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，腺嗓吟核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U=52.8)，病毒的的单链具有侵染性。基因组中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2193个氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，在其两侧分别为746个核苷酸的5’—非编码区(UTRs)和83个核苷酸的3’—非编码区。在3’—非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)，而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白编码IA(多肽VP4)、IB(多肽VP2)、IC(多肽VP3)、ID(多肽VP4)四个病毒外壳蛋白;P2前体蛋白编码ZA(特异性蛋白酶)、2B、2C;P3前体蛋白编码3A、VPg(5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组份)。病毒的单链RNA具有感染性。病毒RNA正链和负链的5’末端和3’末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号。VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS’末端的pUPU形成磷酸二酷键与基因组RNA结合。5’ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译的过程中发挥重要作用。此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。EV71病毒基因组3‘UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚。

2 病毒的复制 　　EV71基因组的复制类似于其它正链RNA的病毒。当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始进行复制。病毒基因组RNA首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用下合成负链RNA。后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。体外实验证实:病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋白VPg以及一种以上的宿主细胞蛋白。随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代毒粒的组装阶段。由于蛋白酶3C或3CD的增多以及活性的增强，加速了Pl前体蛋白的切割。其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg一阴A形成病毒子粒［2］。一般情况下，肠道病毒的原病毒毒粒无感染性，经过蛋白酶的再加工(水解切割P1，产生钾1一4多肽)才产生有感染性的病毒粒子［3］。

3 EV的诊断技术。

3.1 核酸杂交技术 由于EV各型间存在序列高度保守区,利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大范围的EV诊断［4］。杂交技术已能成功地检测出可疑病例临床标本中的EV RNA［5］,而且原位杂交技术可以提供病毒感染的组织细胞分布及其与炎症和坏死之间的关系的信息［6］。但是核酸杂交技术过程较复杂,且敏感性不太高,特别当用于检测脑脊液中RNA时。

3.2 逆转录(RT)PCR技术 根据EV属特异性的高度保守序列设计其通用引物,为提高其检测敏感性,进行套式PCR能够检出包括无法进行细胞培养和定型的大部分EV分离物,还可直接从临床标本中检测EV核酸,整个过程一般在5h左右完成［7］。周世力［8］利用逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,以MycTag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子,甲醇诱导表达。SDSPAGE分析显示:表达产物的分子量约为30 000,与天然VP1大小一致;表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性。