非甾体消炎药对结肠癌细胞HT—29中 瘦素作用的初步研究
非甾体消炎药（NSAIDs）是一类以抗炎为主，兼有解热、镇痛作用的药物。近20年来，动物实验、临床研究、个案报道和流行病学资料均显示NSAIDs药物对腺瘤性息肉有治疗作用，并可以预防结肠癌的发生，但其机制尚未完全阐明。目前研究发现瘦素（Leptin）作为一种具有促生长作用的激素，在许多恶性肿瘤中都存在表达，推测其在刺激恶性肿瘤细胞的增殖、调节肿瘤血管的生成及肿瘤侵袭、转移等方面起重要作用。本实验则旨在观察NSAIDs药物对HT—29结肠癌细胞中瘦素的作用，在理论上初步阐明其抗结肠肿瘤的可能机制。
1材料和方法。
1.1材料人类结肠癌细胞株HT—29购自湘雅医学院肿瘤研究所，Leptin、表皮生长因子（EGF）、阿斯匹林购自Sigma公司，NS—398购自Cayman公司，其他如RPMI1640培养基、0.5%MTT溶液、D—Hank′s液、0.25%胰蛋白酶、碘化丙啶、青霉素G、链霉素、0.5MPBS等试剂由武汉大学医学院消化及肝病研究所配备。主要仪器有恒温二氧化碳培养箱、XDS—1型倒置显微镜、自动移液器、Digiscan SA1000A型酶联免疫检测仪、YJ— 875S超净工作台、Beckman离心机（JM—6）、1808自动双重纯水蒸馏器等。
1.2 方法 1.2.1细胞培养 人类结肠癌细胞株HT—29常规培养于含有10%小牛血清、50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RP—MI1640培养液中，在37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养，每3天用0.25%胰蛋白酶消化传代一次。正常生长状态下的HT—29细胞为上皮样，单层贴壁生长。每次实验时使用苔盼蓝染色，活细胞记数大于98%。
1.2.2细胞记数法检测NSAIDs药物对瘦素促进细胞生长的影响 取亚融合状态的HT—29细胞，0.25%胰蛋白酶消化后在显微镜下观察，制成单细胞悬液。用吸管轻轻吹打细胞悬液后，在血球记数板上加微量细胞悬液，加样量不要溢出玻片，也不要过少或带气泡，以覆盖血球记数板四角大方格为宜。记数:显微镜下，用10×物镜观察记数板四角大方格中的细胞悬液，细胞压线时，只计左侧和上方者，不记右侧和下方者。计算细胞密度:细胞密度=细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104 ，连续记数3次，调整至平均值为4.4×104 ;取182μl细胞原液，补加818μl培养液即成8×104 个细胞。实验共分5组:①空白对照组;②溶煤对照组;③瘦素组（200 ng/ml）;④NS—398（10μM）+瘦素（200 ng/ml）;⑤阿斯匹林（2mM）+瘦素（200 ng/ml）。以上每组均置于37℃、5%CO2 培养箱中培养72h。药物干预后，每天每组取3孔测细胞数。记数前，用冷PBS轻轻震荡，以便去除死细胞。记数方法同前，计算其平均值。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。
1.2.3细胞增殖的检测采用MTT比色法 取对数生长期的HT—29细胞按传代方式制成单细胞悬液，细胞密度为5×104 /ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200μl（相当于1×104 个细胞），另取一孔加入不含细胞的培养液作为空白调零。将培养板置在37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养24h后，设实验组①和②以及对照组。培养24h后，实验组①加入浓度分别为5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml的瘦素后，再加入浓度为2mM阿斯匹林;实验组②加入浓度分别为5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml的瘦素后，再加入浓度为120μmol/L NS—398;对照组则为不加NSAIDs药 物的以上浓度瘦素组，每组3复孔。此后每天更换培养基及加药使其保持药物浓度，在培养板每孔加入0.5%MTT液20μl，在培养4h后，小心吸除孔内液体，每孔加入二甲基亚砜200μl，震荡10min后，用自动酶标仪于492nm波长下测定各孔的吸光度值（OD值）。
2统计学处理。
采用统计软件SPSS10.0分析。根据资料性质，实验数据以均数±标准差表示，用随机区组设计资料的方差分析， P 0.05认为差异有显著性。
3结果。
3.1细胞记数细胞接种后，空白组及溶煤组细胞生长正常，瘦素组（200ng/ml）细胞数目明显增加，而阿斯匹林和NS—398干预的瘦素组细胞数目明显减少，低于空白组及溶煤组，且随时间的延长而下降。见图1。
2.2MTT检测为进一步确定NSAIDs药物干预瘦素促HT—29细胞生长的作用，本实验同时采用MTT法检测细胞生长情况，结果发现，阿斯匹林和NS—398干预的瘦素组较单纯瘦素组比较，HT—29细胞的生长出现抑制现象，在72h内呈时间依赖性。结果见表1～3。
注:不同浓度组之间OD值比较: F=256.034，P0.05，
其中两两比较:P 0.05;不同天数之间OD值比较:F=49.858， P0.05，其中两两比较，P 0.05。
表2 MTT法观察阿斯匹林干预瘦素 对HT—29细胞生长的影响 （略）。
注:不同浓度组OD值比较: F=205.771，P0.05，两两间比较，P 0.05;不同天数间OD值比较: F=58.522，P 0.05， 两两间比较，P 0.05。