FK506治疗大鼠早期膜性肾病的实验研究

作者：贾冶 王晶 顾华 吴曼。

郭桥艳 徐锋 刘庆鑫 许钟镐 苗里宁。

【摘要】 目的 观察FK506治疗大鼠膜性肾病的疗效。方法 复制Wistar大鼠膜性肾病模型。实验分为3组：正常组(N组)，模型组(M组)，FK506治疗组(FK506组)，每组12只。用阳离子化牛血清白蛋白制作大鼠膜性肾病模型,于正式免疫开始后2、4、6、8 w检测大鼠24 h尿蛋白定量;最后心脏取血，测定血清肌酐、尿素氮、白蛋白水平。处死大鼠后取肾观察肾组织病理改变;应用免疫组织化学方法检测肾组织中TGFβ1与NFκB的表达，应用Western印迹法测定大鼠肾组织中TGFβ1蛋白表达的变化。结果 M组与N组相比出现大量蛋白尿，血清白蛋白水平降低。免疫组化检测结果示M组TGFβ1和NFκB的表达均高于N组，而FK506组的水平低于M组。Western印迹法显示M组及FK506组TGFβ1高于N组，FK506组的水平低于M组。 结论 FK506能降低膜性肾病大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，可抑制肾组织TGFβ1与NFκB的表达，用其防治大鼠早期膜性肾病有较好的疗效。

【关键词】 FK506;TGFβ1;膜性肾病。

【Abstract】 Objective To investigate the effect of FK506 on the membranous nephropathy in rat. Methods Membranous nephropathy rats were induced by CBSA. Wistar rats were divided into normal control (N),membranous nephropathy (M),and FK506 treatment (FK506) groups. Urinary protein excretion was measured at 2, 4, 6, 8 w from the beginning of immunization. The rat blood was obtained via cardiac puncture, and the kidneys were removed. The blood samples were saved for measuring the levels of serum BUN, Scr and ALB. Kidney specimens were routinely processed for light microscopy. Immunohistochemistry method was performed to observe the expressions of TGFβ1 and NFκB. TGFβ protein expression was measured by Western blot. Results Urinary protein excretion in group M was significantly higher than that in group N. The level of serum ALB in group M was lower than that in group N. Upregulation of TGFβ1 and NFκB expression were observed in immunohistochemical findings. Conclusions with that in M group, urinary protein excretion was significantly decreased and the level of serum ALB was significantly increased in FK506 group. Immunohistochemistry showed that the expressions of TGFβ1 and NFκB were significantly lower in FK506 group than those in group M. The TGFβ1 protein expression was significantly lower in FK506 group than that in M group by Western blot. Conclusions FK506 can reduce urinary protein excretion, increase the level of ALB, improve kidney pathological changes, inhibit TGFβ1 overexpression and NFκB activation in renal tissue of membranous nephropathy rats, and can be used for treatment of early membranous nephropathy.

【Key words】 FK506; TGFβ1; Membranous nephropathy。

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是中老年人常见的肾脏疾病，临床以无症状蛋白尿或肾病综合征为主要表现，病理以肾小球基底膜(GBM)上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉着伴基底膜增厚为特点。MN的病因及机制尚不清楚，目前治疗主要应用激素加免疫抑制剂。FK506做为一种新型的免疫抑制剂，目前主要用于器官移植，并且在治疗特异性皮炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性眼病等疾病中发挥作用，而在治疗肾小球肾炎，尤其是MN方面的研究尚少。本实验观察FK506对MN模型大鼠24 h尿蛋白定量、肾功能、肾组织TGFβ1、NFκB的影响，旨在探讨FK506对MN的治疗作用及其机制。

1 材料与方法。

1.1 主要试剂和材料 FK506(爱尔兰藤泽药品有限公司)，牛血清白蛋白(上海缘聚生物科技有限公司)，碳化二亚胺(沈阳国药集团)，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体(北京莱博生物实验材料研究所)，兔抗大鼠NFκB p65多克隆抗体(NFκB)(武汉博士德生物工程有限公司)，考马斯亮蓝法测尿蛋白试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，免疫组织化学试剂盒(美国Dako Corporation)。

1.2 方法 健康Wistar大鼠，雄性，重200～230 g(吉林大学基础医学院动物实验中心)，参照Border法〔1〕建立大鼠MN模型，根据实验用药，将动物随机分为3组，每组12只。正常对照组(N组);模型组(M组)，不予任何药物治疗;FK506治疗组(FK506组)，由开始正式免疫第3周起每天给予FK506(2 mg/kg)灌胃，共4 w。M组和N组每日同等剂量溶媒灌胃。实验中于模型大鼠正式免疫开始后2、4、6、8 w将大鼠放入金属代谢笼中，准确收集24 h尿液。留取最后一次24 h尿液。各组大鼠经乙醚麻醉，先行心脏取血，收集血样本，静置后4℃离心15 min，3 000 r/min，取血清保存在—70℃冰箱待测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)水平。最后剖开腹腔，游离肾脏，取多块肾组织，一部分在—70℃冰箱保存，一部分置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.3 免疫组织化学法 采用免疫组化染色法，检测肾组织中TGFβ1和NFκB的表达情况。石蜡切片常规脱蜡水化;1% H2O2作用15 min，PBS洗;0.05%胰蛋白酶液37℃作用30 min，PBS洗;10%正常山羊血清孵育15 min抑制非特异性结合;滴加TGFβ1和NFκB一抗，4℃过夜，PBS洗;滴加二抗(生物素化兔抗鼠IgG)，37℃孵育30 min，PBS洗;滴加复合物(链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液)，37℃孵育30 min;DAB显色，水洗后用苏木素复染，透明封片。

1.4 Western印迹法 用超声碎裂法提取蛋白后，根据蛋白浓度取等量蛋白，在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳后转移至尼龙膜上。在丽春红染液中染色观察蛋白转移情况并标出蛋白质相对质量分子质量标准。然后用5%脱脂牛奶进行封闭，之后加入抗TGFβ1进行杂交，4℃过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行杂交，室温孵育1 h。再次洗膜后用ECL试剂显像并曝光成像。利用图像分析系统扫描确定X片上杂交条带的相对吸光度值。

1.5 统计学处理 数据以x±s表示，应用SPSS11.5软件包进行统计分析，两组以上比较采用ANOVA检验。

2 结 果。

2.1 大鼠MN模型的建立 实验中发现大鼠自正式免疫后2 w出现蛋白尿,尿蛋白试纸测定结果为(～),24 h蛋白定量明显高于N组(P0.05)。继续给予CBAS后，第4周末时定性检查为(～)，24 h尿蛋白定量明显增加，与N组比较提示为大量蛋白尿(P0.05)。处死大鼠后留取血清测定。

ALB，与N组比较提示ALB水平降低(P0.05)，Scr、BUN水平较正常无明显差异。肾组织病理检查示肾小球毛细血管壁明显增厚、僵硬，偶可见钉突形成，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样及局灶空泡变性，小管内可见蛋白管型，PAM+MASSON染色可见肾小球基底膜增厚、僵硬，偶可见钉突形成，上皮下疑似嗜复红物存在。电镜观察示肾小球基底膜增厚，足突融合变平或消失，上皮下可见团块状电子致密物沉积，足细胞肿胀、形状不规则，胞质空化、轻度绒毛化，内质网扩张，溶酶体明显增多。

2.2 大鼠24 h尿蛋白、Scr、BUN、ALB变化 与N组相比，M组自正式免疫后2、4、6、8 w的尿蛋白定量均明显升高(P0.01)。FK506组于给药后2、4 w的24 h尿蛋白量均明显高于N组，但明显低于M组(2 w时P0.05，4、6、8 w时P0.01)(见表1)。与N组比较，M组的血清ALB水平降低(P0.01);FK506组ALB水平较M组明显升高(P0.01)(见表1)。各组间血清肌酐、尿素氮差异均无显著意义(见表1)。