钛铌锆β钛合金生物相容性的体外实验研究
作者：贾庆卫，宁聪琴，丁冬雁，汤亭亭，严孟宁, 周新社，戴尅戎。
【摘要】 ［目的］通过体外实验对自行研发的低弹性模量、高强度新型β型钛合金人工关节假体材料生物相容性进行评价。［方法］（1）采用L—929细胞（小鼠成纤维细胞）对合金进行细胞毒性试验，将细胞相对增殖率（RGR）转换成6级材料毒性进行评级。（2）将1 μm左右的钛铌锆合金（Ti—Nb—Zr）颗粒与J774A.1巨噬细胞体外共同培养24～48 h后，采用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞变化、RT—PCR方法测定IL—6和TNF—α表达、ELISA法测定细胞培养上清TNF—α等方法对Ti—Nb—Zr的生物相容性进行评价，并与传统的人工关节假体材料进行比较。［结果］Ti—Nb—Zr的细胞毒性为0级。吞噬了Ti—Nb—Zr颗粒的J774A.1巨噬细胞形态改变明显轻于钴铬钼颗粒组和钛铝钒颗粒组。巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti—Nb—Zr颗粒共同培养48 h后都有IL—6和TNF—α mRNA表达的增加，钴铬钼颗粒和钛铝钒颗粒引起增加更加明显。ELISA方法测定显示：巨噬细胞吞噬Ti—Nb—Zr颗粒48 h后分泌TNF—α的量明显低于钛铝钒和钴铬钼（P0.05）。［结论］低弹性模量Ti—Nb—Zr 钛合金具有优良的体外组织相容性，是一种有前途的骨科内植物材料。
［Method］（1）the cell toxicity of Ti—Nb—Zr was evaluated using L—929 cell line‘s relative growth rate (RGR) which was transformed into 6 toxicity ranks in according with the national standard;（2）the J774A.1macrophages cultured with Ti—Nb—Zr particles whose diameter was about 1 μm for 24—48 hours were observed using inverted phase contrast microscopy and transmission electron microscopy. Expression of IL—6 and TNF—αmRNA in these cells were measured using RT—PCR technique. The TNF—α in the supernatant was also measured using ELISA method. All the results were compared with the traditional orthopedic implants metal materials such as Ti—6Al—4V and Co—Gr—Mo.
［Result］The cell toxicity of Ti—Nb—Zr was ranked zero degree. The particles could be seen in the macrophages under the light microscopy. Ti—Nb—Zr particles made the J774.A1 macrophages less configurative changes than Ti—6Al—4V and Co—Gr—Mo did.Expressions of IL—6 and TNF—αmRNA in J774.A1 cell were increased after stimulation for 48 hours by all kinds of metallic materials. The TNF—α in the supernatants of Ti—Nb—Zr group were less than that of the Ti—6Al—4V and Co—Gr—Mo groups (P0.05).
［Conclusion］The Ti—Nb—Zr beta titanium alloys developed in the author‘s lab have lower modulus and good biocompatibility. It is a promising material for orthopedic implants.
Key words：titanium—niobium—zirconium; biocompatible materials; in vitro。
目前使用的人工关节假体和内固定大多以高弹性模量金属材料制造，置入体内易产生“应力遮挡”效应，导致植入物周围骨吸收，这是引发假体松动和内固定节段骨质疏松的主要力学原因［1、2］。以Ti—6Al—4V为代表的钛合金弹性模量低于钴铬钼合金和不锈钢，但是仍然偏高，且含有V和Al 两种被认为是对生物体有毒的元素，因此研制生物相容性更好的低弹性模量材料成为骨科人工关节材料发展的方向。β型钛合金以其生物相容性优良的合金元素构成和独特的晶体结构满足了人们对生物材料生物相容性和低弹性模量力学相容性的要求，同时又具有足够的力学强度，成为骨科生物材料研究的热点［3］。
作者通过向钛基中加入相容性更好的合金元素Nb、Zr等元素，在国内首次成功研制钛铌锆β型钛合金（Ti—Nb—Zr）。Ti—Nb—Zr的抗拉强度：706～874 MPa，弹性模量：59～66G Pa，延伸率：5.4％～20%。达到了低弹、高强的设计目标［4］。本研究通过多种体外实验的方法进一步对其生物相容性进行评价，与传统的人工关节假体和内固定材料进行比较，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法。
1.1 钛铌锆β型钛合金（Ti—Nb—Zr）的研制。
将合金元素（钛、铌、锆）按不同比例混合，在真空自耗电弧炉中熔炼、浇注成圆棒（铸造态）。取铸造态材料在高温区锻造，可得到锻造变形合金（图1）。
采用作者实验室研发的设备，制备Ti—Nb—Zr颗粒供实验使用［5］。颗粒平均直径（Dv90）为1.001 μm，99.93%的颗粒在0.3～1.2 μm之间。
使用L—929细胞（小鼠成纤维细胞），实验细胞为传代48～72 h生长旺盛细胞。细胞培养基为含10%（V/V）小牛血清的Eagle′s MEM加入中。将Ti—Nb—Zr薄片（厚度≤1 mm）用肥皂水清洗，重蒸馏水洗涤，滤纸吸干，医用不锈钢丝悬吊，高压蒸汽灭菌备用。
根据国家技术标准GB/T16175—1996对合金进行细胞毒性试验（测试温度为24℃，湿度为58%）。将同一时间组内光吸收值作方差分析并进行均数间两两比较，通过光吸收值绘制细胞增殖曲线计算细胞相对增殖率（RGR），并将其转换成6级材料毒性评级（表1）。表1 GB/T16175—1996中材料毒性分级标准。
J774A.1巨噬细胞株来源于BALB/c小鼠网状细胞肉瘤，由American Type Culture Collection Co.（Rockville,MD,USA）提供，培养在含10%小牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期的细胞，以2×105/ml接种于6孔板中，培养4～6 h后，分别加入钴铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒颗粒混悬液和Ti—Nb—Zr颗粒混悬液（107个/孔），另外分别于35 mm培养皿中按上述方法接种细胞，同时设置不加任何刺激物的对照孔。刺激后24 h用2.5%戊二醛溶液固定，进行倒置相差显微镜观察并摄像。
J774A.1巨噬细胞分别加入铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒合金颗粒混悬液和Ti—Nb—Zr颗粒混悬液（107/孔）作用24 h用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子将全部细胞从皿底上轻轻刮下，收集在离心管中2 000 r/min离心20 min，弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进行漂洗、1%锇酸后固定15 min、漂洗、脱水、浸透，将样品从棉花纸内取出进行包埋，60℃烘箱内48 h，超薄切片，透射电镜观察并摄像。
1.6 巨噬细胞RT—PCR测定IL—6和TNF—α表达。
J774A.1巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和Ti—Nb—Zr合金颗粒分别培养24、48 h后收集细胞用于抽提RNA。设置不加颗粒的空白对照组。
根据GeneBank中 IL—6，TNF—αcDNA的序列设计引物。
IL—6上游序列： 5‘—TTCTTGGGACTGATGCTG—3‘ 。
下游序列： 5‘—CTGGTCTTGTCTTTCTTGTT—3‘。产物大小1 087 bp。
TNF—α上游序列： 5‘— GGGCTTCCAGAACTCCAG—3‘。
下游序列： 5‘—CAATGACTCCAAAGTAGACC—3‘ 产物大小为 635 bp。
同时以鼠GAPDH为对照，
引物的上游序列： 5‘—CTGCACCACCAACTGCTTAG—3‘。
下游序列：5‘—GTCTGGGATGGAAATTGTGA—3‘，产物大小为 660 bp。
采用异硫氰酸胍－酸性一步法提取细胞总RNA进行RT—PCR。PCR扩增条件如下：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性30 s，50℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 90 s，35个循环；72℃ 延伸 10 min。
J774A.1巨噬细胞分别加入铬钼合金颗粒混悬液、钛铝钒合金颗粒混悬液和Ti—Nb—Zr颗粒混悬液（107/孔）作用24h和48h时分别抽取细胞培养上清液，—75℃冻存。TNF—α的测定用ELISA试剂盒(购自BioSource U.S.A Headquarters)。TNF—α测定的按操作程序进行。
1.8 统计学分析。
所有测量结果经SAS 6.12软件处理。组内各参数之间的比较用方差分析，两两比较用q检验，以P0.05表示差异有显著意义，P0.01为差异有非常显著性意义。
2 结果与分析。
测试结果（表2）。试验结果表明该合金的细胞毒性为0级，表明此合金具有很好的细胞相容性。表2 Ti—Nb—Zr合金的细胞毒性试验结果。