木瓜中多糖的提取、分离与鉴定
摘 要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、复合提取法从木瓜中提取多糖，经过分离纯化后，进行IR鉴定。
关键词：木瓜；多糖；提取；分离；鉴定 0 前言 多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是一种具有广泛生物活性的大分子。
从各种中草药和其他植物中都可以提取分离出多糖，我国近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛报道。
木瓜原名番木瓜，始载于《名医别录》，属蔷薇科木瓜属植物，是我国特有果木之一，主要生长在亚热带温暖湿润的山区地带，是一种药食同源的植物，性温味酸。
现代医学证明：木瓜果实中含有丰富的糖分、番木瓜碱、木瓜蛋白酶，并含有17种以上的氨基酸及多种微量元素。
目前已有大量木瓜产品上市，如木瓜饮料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人们的喜爱。
湖北建始县盛产木瓜，但是创收的途径主要是通过销售鲜木瓜或干木瓜，其他相关产品的开发并不多见。
从木瓜中提取和分离鉴定具有保健和药理活性的功能性成分，对于提高木瓜的经济价值，解决目前农民木瓜丰产不丰收、大量木瓜急待加工开发的问题具有积极的意义。
本实验对木瓜中多糖进行研究，拟对其提取工艺进行优化，并对粗多糖进行分离纯化鉴定组成和结构进行初步表征，为进一步提高木瓜的附加值提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 （1）原料：湖北省建始县干木瓜片，粉碎机粉碎 （2）仪器：TDL—5—A 台式离心机，UV—7504 紫外—可见分光光度计，SHZ—Ⅲ型循环水真空泵，紫外扫描仪 ，付立叶变换红外光谱仪 ，Prostar高效液相色谱仪等。
（3）试剂：石油醚（沸程60—90℃），丙酮，乙醇（95%），戊醇，三氯甲烷，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，硫酸，盐酸，苯酚 ，葡萄糖，乙醚，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液 ，硫酸铜，酒石酸钾钠， D—半乳糖 ，溴化钾 ，碳酸钡。
分别用索氏抽提法，水提醇沉法，乙醇回流提取法，复合提取法提取木瓜中的多糖，并比较多糖得率，选择较好的水提醇沉法进行优化处理。
②水提醇沉法提取多糖工艺的优化 单因素试验 a温度对提取率的影响：加水量为30ml，水提时间为30分钟，分别在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃的水浴条件下，提取多糖，用苯酚—硫酸法测定其含量， b加水量对提取率的影响：水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚—硫酸法进行测定， c水提时间对提取率的影响：水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响， 正交试验 根据单因素实验的结果，选取合适的水平，对其进行优化处理。
①蛋白质的去除：分别用Sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除样品中的蛋白质。
②低聚糖等小分子杂质的去除：通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。
③多糖的柱层析纯化：采用DEAE—52纤维素离子交换柱柱层析方法进行。
依次用0.5mol／L的NaOH、HCl和蒸馏水处理填柱材料至中性，反复处理三次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱。
用pH=7.6PBS溶液平衡48小时。
称取粗多糖1.0g，溶于少量蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液过柱。
用0.1—2.0mol／L的NaCl—PBS溶液梯度洗脱，控制流速为1ml／min，采用部分收集器按5ml／tub收集。
以苯酚—硫酸法测吸光值（490nm）作洗脱曲线，根据吸光值将同一组分合并。
①淀粉的碘反应：将纯化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加热，观察颜色是否有变化，同时做淀粉的对比试验。
②溶解性：称取纯化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常温下搅拌，观察其溶解性。
③还原糖的测定：取0.1 mg／ml的多糖溶液50ml于试管中，在80℃的恒温水浴锅中保温30分钟，吸取6ml，加入4ml的斐林试剂（等体积的斐林试剂A液和斐林试剂B液混合），于590nm处比色。
④蛋白质的测定：将纯化得到的多糖在190— 400nm处进行UV扫描，观察在250—280nm处没有吸收峰，判断是否有核酸和蛋白质的存在。
⑤IR鉴定多糖中糖苷键的类型：将多糖与溴化钾烘干后，称取多糖2mg与100mg的溴化钾研磨，压片，置于红外图谱分析仪中作红外分析。
⑥HPLC鉴定多糖中单糖的组成：用高效液相色谱法对木瓜多糖的单糖组成进行定性鉴定。
样品的处理：称取纯化后的多糖10.0mg，加1mol／L的硫酸2ml，充N2后于100℃水浴加热5h，用BaCO3中和，膜过滤后作为待测样品。
标准液的配制：称取葡萄糖、半乳糖25mg，分别溶于5ml的蒸馏水中，配成5mg／mL的标准液，膜过滤后待用。
色谱条件：以Aglient Zorbax Carbohydrate(4.6×250㎜,5um)糖分析柱为固定相，80%的乙腈为流动相，流速1.0mL／min，柱温25℃。
利用示差检测器进行检测，进样量为20uL，分别对葡萄糖和半乳糖标样及样品进行检测。
2 结果与分析 2．1 标准曲线的建立 本研究采用苯酚—硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标准建立标准曲线，见图2—1。
由上图可知，回归方程为y=0.0552x+0.0383，R2=0.9981。
线性关系较好，可以以此来测定多糖的含量。
对四种提取法方法进行对比，由吸光值可得其相对得率，结果见图2—2。
图2—2 不同提取方法提取率的比较 比较以上四种提取方法，本研究选定较好的水提醇沉淀法作为提取木瓜中多糖的方法，并在单因素试验的基础上，通过正交试验进行优化提取工艺。
（2）单因素实验。
①温度对提取率的影响。
由图2—3可以得到，在相同的加水量及水提时间的条件下，在90℃时多糖的得率较高，提取效果较好，分析其原因，可以知道，升温有利于粗多糖得率提高，为获得较高提取率，应选择较高温度，但是温度超过90℃时，不仅多糖的生物活性有可能遭到破坏，而且考虑到大幅度升温会带来能源消耗。
综合考虑效比，选择85℃、90℃、95℃作为正交试验的因素水平。
水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚—硫酸法进行测定，结果见图2—4。
由图2—4可以得到，在相同水浴温度及水提时间的条件下，加水量为40ml时，多糖的得率相对较高，效果较好。
在加水量为25ml或30ml时，由于水提的效果并不好，从而影响到醇沉效果，多糖的得率并不高，但加水过大，提取率反而下降，因此，加水量过少或过多均会造成多糖得率的降低。
可以选择加水量30ml、45ml、60ml作为正交试验的三个水平。
水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响，结果见图2—5。
由图2—5可知，水提时间越长，粗多糖的得率越高，当时间超过30分钟时，提取率增加量开始减少，在40分钟时，提取率最大，考虑到能源消耗、生产周期延长都会增加生产成本，水提时间不宜过长，因此选择15min、20min、30min作为正交试验的三个水平。