化瘀理肺方对大鼠肺纤维化氧化应激及MMP2/9活性的影响
作者：王琴 刘世青 王允山 焦芳芳 李长生。
【摘要】 目的 研究化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成的干预作用及其机制。方法 将大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、激素组，用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，经气管内插管注入博莱霉素(5 mg/kg)建立肺纤维化模型，对照组注入生理盐水0.25 ml作为正常对照，从造模后的第2天起分别给予化瘀理肺方药物灌胃（中药组，13 410 mg/kg）、生理盐水灌胃（对照组、模型组）、氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射（激素组，25 mg/kg）进行干预，于给药后的14、28 d分别处死。取肺组织进行丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性检测，以及应用凝胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的活性。结果 中药组肺MDA明显低于模型组和激素组、SOD及GSHPx活性明显高于模型组和激素组；中药组MMP2/9的活性明显低于模型组和激素组（P＜0.05）。结论 化瘀理肺方对博莱霉素所致肺纤维化大鼠有一定预防性治疗作用，可能通过抗氧化和改变MMP2/9的活性而发挥作用。
【关键词】 肺纤维化；化瘀理肺方；氧化应激；MMP2/9。
肺纤维化是多种原因引起的慢性肺间质性疾病的共同病理过程，发病机制尚不完全明确。其病理特点包括肺组织间质细胞增殖、细胞外基质（ECM）增生沉积及肺实质的重构，其中氧化应激的增强及ECM代谢失衡在肺纤维化的发生发展中具有重要的作用〔1〕。ECM主要由基质金属蛋白酶(MMP)降解。MMP2和MMP9的底物是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分，肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的关键问题。目前对肺间质纤维化临床上尚无有效的治疗方法，近年来临床报道显示中医辨证与辨病结合组方用药能提高疗效且副作用小。笔者在原有中医药防治肺纤维化理论基础上，进一步探讨化瘀理肺方干预肺纤维化的作用机制。
1 材料与方法。
1.1 动物 Wistar雄性大鼠44只，体重（200±20）g，清洁级，由山东大学试验动物中心提供（动物合格证号为ssxk(鲁)20030004）。
1.2 药品与试剂 化瘀理肺方由丹参、半夏、当归、水蛭、黄芪、补骨脂、薏苡仁、鱼腥草、地龙等组成，所用中药为浓缩颗粒剂，由江阴天江药业有限公司生产（生产批号为0509025），经溶解配成含生药1 341 g/L的溶剂，高压灭菌，4℃冰箱保存备用；注射用盐酸博莱霉素(15mg/支)由日本化药株式会社生产（产品批号为950330），使用时以生理盐水配成1 g/L；氢化可的松琥珀酸钠（50 mg/支）购自天津市生物化学制药厂（产品批号为20060301）。
1.3 模型的建立、动物分组与标本处理 模型制备参考Taooka等的方法〔2〕。大鼠44只，随机分为4组：模型组（博莱霉素+生理盐水）、中药组（博莱霉素+化瘀理肺方）、激素组（博莱霉素+氢化可的松琥珀酸钠）、对照组（生理盐水+生理盐水），中药组14只，其余每组10只。用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉，固定四肢及头部，暴露声门，在额镜直视下，将与1 ml注射器相连的带接头硬脊膜外麻醉导管插入气管，前3组注入0.4%博莱霉素0.25 ml(5 mg/kg)，第4组注入生理盐水0.25 ml作为正常对照，注药后立即将动物直立旋转，使药物在肺内分布均匀。次日开始，中药组每天给予化瘀理肺方药物灌胃（13 410 mg/kg），激素组每天给予氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射(25 mg/kg)，对照组和模型组每天给予生理盐水（2 ml/只）灌胃。给药后第14 d和28 d每组各处死5只大鼠（中药组处死7只），取右肺中叶置于10%中性福尔马林固定。
1.4 肺组织丙二醛（MDA）含量与超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性测定 MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；SOD活性采用联苯三酚自氧化法；GSHPx活性采用NADPH偶联法。严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所出品)说明书操作。
1.5 肺组织基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）活性检测 采用明胶酶谱法〔3〕，提取肺组织总蛋白；制备SDS明胶聚丙烯酰胺凝胶。取30 μg总蛋白进行还原但非变性电泳。凝胶经脱液、漂洗、孵育后，用考马斯亮蓝染色液予以染色，显示MMP2/9位于蓝色背景上的透明亮带。对条带进行图像分析，测定其灰度值，代表MMP2/9活性。每项实验重复检测5批以上的不同样本。
1.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计学处理，数据以x±s表示。同一时间点的4个组进行单因素方差分析，并用q检验进行不同组间的两两比较。
2 结 果。
2.1 大鼠肺组织MDA含量的变化 检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织中MDA含量在14 d即有增高，28 d增高更明显。与模型组和激素组相比，中药组大鼠肺组织中MDA含量显著降低，且在28 d时较14 d明显。见表1。表1 大鼠肺组织各时间点MDA含量的变化与对照组比较：1)P＜0.01；与模型组比较：2)P＜0.05，3)P＜0.01；与激素组比较：4)P＜0.05，下表同。