同种异体免疫反应对ITAC及其受体表达诱导的体外研究

作者：祝先进 宋艳芳 , 许伟群， 张秋玉， 苏东辉。

【摘要】 　　目的 探讨同种异体免疫反应对干扰素诱导的T细胞α亚族趋化剂（ITAC）及其受体CXCR3的表达的影响。 方法 同种异体外周血单个核细胞（PBMC）混合培养后，将培养上清液作用于ECV304细胞系，RTPCR检测ECV304的ITAC mRNA表达，ELISA检测培养上清液中IFNγ和TNFα浓度，流式细胞术检测PBMC表面CXCR3的表达。 结果 与单独PBMC培养组相比，混合PBMC培养组上清液中细胞因子干扰素γ（IFNγ）、肿瘤坏死因子α（TNFα）的表达显著升高，且能促进ECV304细胞ITAC mRNA的表达；混合培养后PBMC表面CXCR3的表达亦呈显著升高。 结论 同种异体免疫反应可能通过细胞因子、趋化因子ITAC及其在T细胞上的受体CXCR3的表达，以正反馈形式加剧同种异体移植排斥反应。

【关键词】 移植，同种； 趋化因子类； 受体，趋化因子； 内皮细胞； 内皮，血管； 脐静脉。

在器官移植中，受者T细胞被募集并穿过血管内皮细胞层进入移植物是宿主抗移植物急性和慢性移植排斥反应发生的最重要条件。干扰素诱导的T细胞α亚族趋化剂（IFNinducible T cell alpha chemoattractant，ITAC）是不久前发现的一种趋化因子，又称为CXCL11,其受体是CXCR3，主要表达于Th1细胞表面。ITAC已被证实对Th1细胞具有强大的募集作用，因此被认为是引起移植排斥的关键因素之一[13]。已有研究显示，IFNγ能够诱导星形胶质细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等表达ITAC[3]。本研究以人细胞株ECV304和人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）作为研究对象，通过体外混合淋巴细胞培养，建立模拟移植排斥反应的体外实验模型，研究同种异体免疫反应过程中，ITAC及其受体CXCR3表达的变化，藉此探讨ITAC在移植排斥中的作用，为移植排斥的治疗提供新依据。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 主要试剂 RPMI1640培养基和胰蛋白酶（美国Hyclone公司），鼠IgG1FITC（美国 RD公司），鼠抗人CXCR3FITC（美国Research Diagnostics Systems 公司），Trizol（美国Invitrogen公司），一步法RTPCR试剂盒（美国Promega公司），TNFα ELISA试剂盒和IFNγ ELISA（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.1.2 主要仪器 PCR扩增仪（2400型，美国PE公司），流式细胞仪（美国Coulter公司）。

1.2 方法。

1.2.1 ECV304细胞的培养 ECV304细胞为福建医科大学生物医药中心提供。复苏细胞加RPMI1640培养液（含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素链霉素），置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。

1.2.2 PBMC的分离和培养 Ficoll法分离PBMC，加RPMI1640培养液，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。

1.2.3 同种异体PBMC的混合培养 将取自不同健康志愿者A和B的PBMC浓度调整为1×106 mL—1，将PBMCA和PBMCB混合培养于含20% FBS的RPMI1640完全培养液中。同时设单独PBMCA和单独PBMCB的细胞培养组。置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养12 h。离心，取各组细胞、上清备用。

1.2.4 RTPCR ECV304细胞接种到六孔细胞培养板，待长满80%，加入1.2.3所得各组细胞培养上清液1 mL。A组：加入单独PBMCA培养上清；B组：加入单独PBMCB培养上清；A+B组：加入PBMCA和PBMCB混合培养上清；C组：对照组，即加入细胞培养液。继续培养12 h。按Trizol说明书，一步法提取细胞总RNA，并进行纯度分析、定量及琼脂糖凝胶电泳观察。D260nm/D280nm限制在1.8～2.0。Promega一步法试剂盒进行RTPCR操作。引物序列：ITAC（218 bp） 　　上游：5’GCTATAGCCTTGGCTATATTG3’ 　　下游：5’GATTTGGGATTTAGGCATAGTTGT3’。

反应体系：无核酸酶水5.5 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，MgSO4 2 μL，AMV反转录酶0.5 μL，Tfl DNA聚合酶0.5 μL，上下游引物各5 μL，模板1 μL。反应条件：反转录45 ℃ 45 min；预变性94 ℃ 2 min；循环94 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→68 ℃ 45 s,共35个循环；68 ℃延伸7 min。取PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 CXCR3的流式细胞术分析 取1.2.3所得细胞于小试管中，分组为：A组：单独PBMCA培养；B组：单独PBMCB培养；A+B组： PBMCA和PBMCB混合培养。用PBS缓冲液（含有0.5％BSA）洗涤3次，调整细胞浓度到2×105 mL—1，加入1 mL的PBS缓冲液，吹打成单细胞悬液。加入人IgG于单细胞悬液中（每105个细胞加入人IgG 1 μg），室温放置15 min。洗涤1次。加入直标抗体：各管中加入鼠抗人CXCR3FITC 10 μL，同型对照组的一管加入鼠IgG1FITC，2～8 ℃下共孵40 min。每小管加入PBS缓冲液2～3 mL，洗涤3次。用0.5 mL PBS缓冲液重悬细胞，上机检测。

1.2.6 同种异体PBMC混合培养上清中IFNγ和TNFα的检测 取1.2.3所得细胞培养上清，用双抗体夹心ELISA法检测TNFα、IFNγ，具体操作严格按说明书进行。

1.3 统计学处理 数据以x±s表示。采用单因素方差分析和t检验进行统计分析，P0.05为差别有统计学意义。

2 结果。

2.1 同种异体PBMC混合培养上清诱导ECV304细胞ITAC mRNA的表达 混合细胞培养上清(A+B)诱导ECV304细胞ITAC mRNA的表达，而单独细胞的培养上清(A，B)和培养液(C)作用的ECV304细胞均未见ITAC表达(图1)。

ITAC：T细胞及亚族趋化剂. M：标准分子量DNA；A+B组：加入PBMCA和PBMCB混合培养上清；A组：加入单独PBMCA培养上清；B组：加入单独PBMCB培养上清；C组：对照组.

图1 混合细胞培养上清对ECV304细胞ITAC mRNA表达的诱导作用（略）。

Fig 1 The expression of ITAC mRNA in ECV304 induced by the culture supernatant from mixed PBMC。

2.2 同种异体混合细胞培养后PBMC上CXCR3表达的变化 混合细胞培养后PBMC上CXCR3表达与单独PBMC培养A/B组相比明显提高（49.200±3.439 vs 41.633±0.950/42.633±2.948），二者差别有统计学意义（P0.05，图2）。